Strömungsregulierte Genexpression in Endothelzellen als Mechanismus der Angioadaption und der Atheroprotektion:
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|---|---|
| adam_text | Zusammenfassung 7
1 Einleitung 8
1.1 Endothel und Hämodynamik 8
1.2 Atherosklerose und Wandschubspannung in Arterien 9
1.3 Durch laminare Strömung induzierbare Atheroprotektion 11
1.3.1 Stickstoffmonoxid 11
1.3.2 „transforming growth factor-ß1 12
1.3.3 Schutz vor Lipidakkumulation in der Arterienwand 13
1.3.4 Antioxidative Mechanismen 13
1.3.5 Hemmung des Komplementsystems 14
1.3.6 Hemmung der Monozytenemigration 15
1.3.7 Hemmung der proatherosklerotischen Mediamyozytenaktivierung 15
1.4 Angioadaptation 17
1.5 Das Angiopoietin/Tie2-System 18
1.6 Fragestellung 21
2 Material und Methoden 22
2.1 Material 22
2.2 Methoden 24
2.2.1 Zellkultur 24
2.2.1.1 Zellisolierung 24
2.2.1 2 Kultivierung zum Monotayef 25
2.2.2 Stimulation der Zellen 26
2.2.2.1 Gruppenbildung 26
22.22 Kegel-Platte Apparat zur Erzeugung von Wandschubspannung 28
2.2.2.3 Zellemte 30
2.2.3 Isolierung von Gesamt-RNA 31
2 2.3.1 RNasen-lnaktivierung 31
2.2.32 Isolierung von Gesamt-RNA 31
2.2.3.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren 32
2.2.4 .Differential display-RT-PCR 33
2.2.4.1 Reverse Transkription (RT) 33
3
2.2.4.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 34
2.2.4.3 Polyacrylamidgelelektrophorese und Isolierung differentiell exprimierter Banden 37
2.2.5 Sequenzierung 39
2.2.5.1 Reamplifikation differentiell exprimierter Banden 39
2.2.5.2 Klonierung 41
2.2.5.3 „Cycle sequencing 44
2.2.5.4 Homologievergleich 46
2.2.6 Bestätigung der differentiellen Expression mittels semiquantitativer RT-PCR 46
2.2.6.1 Prinzip 46
2.2.6.2 Spezifische Primer 47
2.2.6.3 Standardisierung der Versuchsbedingungen 48
2.2.7 Echtzeit-PCR-Analyse der Untereinheit 3 der NADH Dehydrogenase 50
2.2.7.1 Prinzip 50
2.2.7.2 Praktische Durchführung 52
2.2.8 Statistik 53
2.2.8.1 Statistik der semiquantitativen RT-PCR 53
2.2.8.2 Statistik der Echtzeit-PCR 53
3 Ergebnisse 54
3.1 Suche nach wandschubspannungsabhängig exprimierten Genen 54
3.1.1 Ausrichtung der Endothelzellen unter Wandschubspannung 54
3.1.2 Differentiell exprimierte Banden 55
3.1.3 Reamplifikation und Sequenzierung differentiell exprimierter Banden 58
3.1.4 Homologie zu publizierten Sequenzen 60
3.1.5 Von der LDL-induzierten mRNA abgeleitete Aminosäuresequenz 64
3.2 Bestätigung der wandschubspannungsabhängigen Expression
bestimmter Gene 65
3.2.1 Semiquantitative RT-PCR 65
LDL induzierte mRNA 66
Mikrotubulin assoziiertes Protein 4 67
Untereinheit 3 der NADH Dehydrogenase 68
30 kDA Protein 69
mRNA aus einer Teratokarzinomzelllinie 69
Protein GK 001 70
Untereinheit 7 der Cytochrom c Oxidase 71
3.2.2 Echtzeit-PCR der Untereinheit 3 der NADH Dehydrogenase 72
3.2.2.1 Effizienzbestimmung 72
3.2.2.2 exemplarische Zyklusprofile und Schmelzkurven 72
3.2.2.3 relative Expressionslevel der Untereinheit 3 der NADH DH 73
4
4 Diskussion 74
4.1 „differential display-RT-PCR und Alternativen zur initialen Suche
differentiell exprimierter Gene 74
4.1.1 Überblick 74
4.1.2 Subtraktionshybridisierung 74
4.1.3 „differential display-RT-PCR 75
4.1.4 Serielle Analyse der Genexpression 76
4.1.5 Microarray 77
4.1.6 Abschließende Bewertung der „differential display-RT-PCR 79
4.2 Verifizierung der differentiellen Expression identifizierter Gene 80
4.2.1 Analyse strömungsregulierter Gene mit semiquantitativer RT-PCR 80
4.2.2 Expressionssteigerung der „housekeeping GAP DH durch Hypoxie und
Zytokine 80
4.2.3 Nachweis „illegitimer Transkripte durch RT-PCR 81
4.2.4 Aggravierung von Unregelmäßigkeiten durch die Amplifikation 83
4.2.5 Echtzeit-PCR 84
4.2.6 „northem-blot 84
4.2.7 Protein- und Funktionsebene 85
4.3 LDL- und wandschubspannungsmoduliertes Protein (LWMP) 86
4.3.1 Zuordnung der durch Wandschubspannung supprimierten Bande A zu einer
LDL-induzierten mRNA 86
4.3.2 Von der Primärstruktur abgeleitete Funktionen des LWMP 87
4.3.2.1 Prolin-reicher Abschnitt des LWMP 87
4.3.2.2 Zinkfingerdomänen des LWMP 88
4.3.2.3 LWMP im Vergleich zu anderen strömungsregulierten Transkriptionsfaktoren mit dreifachem
C2H2-Zinkfinger 90
4.3.2.4 potentielle Zielgene des LWMP 92
4.3.3 Atherogenese und LWMP 99
4.3.3.1 LDL und Atherogenese 99
4.3.3.2 Polarität des Endothels 100
4.3.3.3 Mangan Superoxid Dismustase und VCAM-1: atheroskleroserelvante, potentielle Zielgene
des LWMP 101
4.3.3.4 subendotheliale LDL-Retention durch Proteoglykane 103
4.3.4 Zusammenfassung und Ausblick: Mögliche Bedeutung der
wandschubspanungsregulierten Expression des LWMP 105
4.4 Untereinheit Vllc der Cytochrom c Oxidase (COX7c) 107
4.4.1 Zuordnung der durch Wandschubspannung supprimierten Bande AN zu der
COX7c 107
5
4.4.2 Die COX7c als funktionell relevante Untereinheit des Holoenzyms 108
4.4.3 Regulation der COX7c-Genexpression 109
4.4.4 Senkung der COX-Aktivität durch oxidative Modifikationen der COX7c und die
resultierende Freisetzung von Signalmolekülen 110
4.4.5 NO als Substrat der Cytochrom cOxidase 111
4.4.6 Supprimierung der Cytochrom c Oxidase durch NO 112
4.4.7 Pathologie der Interaktion von NO mit der Cytochrom cOxidase 114
4.4.8 Zusammenfassung und Ausblick: mögliche Bedeutung der
wandschubspannungsregulierten Expression derCOX7c 115
4.5 NADH Dehydrogenase (NADH DH) 117
4.6 Differentielle Genexpression durch Angiopoietin 2 118
Abkürzungsverzeichnis 120
Abbildungsverzeichnis 123
Tabellenverzeichnis 124
Literaturverzeichnis 125
Lebenslauf 161
Erklärung an Eides Statt 162
Danksagung 163
6
|
| adam_txt |
Zusammenfassung 7
1 Einleitung 8
1.1 Endothel und Hämodynamik 8
1.2 Atherosklerose und Wandschubspannung in Arterien 9
1.3 Durch laminare Strömung induzierbare Atheroprotektion 11
1.3.1 Stickstoffmonoxid 11
1.3.2 „transforming growth factor-ß1" 12
1.3.3 Schutz vor Lipidakkumulation in der Arterienwand 13
1.3.4 Antioxidative Mechanismen 13
1.3.5 Hemmung des Komplementsystems 14
1.3.6 Hemmung der Monozytenemigration 15
1.3.7 Hemmung der proatherosklerotischen Mediamyozytenaktivierung 15
1.4 Angioadaptation 17
1.5 Das Angiopoietin/Tie2-System 18
1.6 Fragestellung 21
2 Material und Methoden 22
2.1 Material 22
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2.2.1 Zellkultur 24
2.2.1.1 Zellisolierung 24
2.2.1 2 Kultivierung zum Monotayef 25
2.2.2 Stimulation der Zellen 26
2.2.2.1 Gruppenbildung 26
22.22 Kegel-Platte Apparat zur Erzeugung von Wandschubspannung 28
2.2.2.3 Zellemte 30
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2 2.3.1 RNasen-lnaktivierung 31
2.2.32 Isolierung von Gesamt-RNA 31
2.2.3.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren 32
2.2.4 .Differential display-RT-PCR" 33
2.2.4.1 Reverse Transkription (RT) 33
3
2.2.4.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 34
2.2.4.3 Polyacrylamidgelelektrophorese und Isolierung differentiell exprimierter Banden 37
2.2.5 Sequenzierung 39
2.2.5.1 Reamplifikation differentiell exprimierter Banden 39
2.2.5.2 Klonierung 41
2.2.5.3 „Cycle sequencing" 44
2.2.5.4 Homologievergleich 46
2.2.6 Bestätigung der differentiellen Expression mittels semiquantitativer RT-PCR 46
2.2.6.1 Prinzip 46
2.2.6.2 Spezifische Primer 47
2.2.6.3 Standardisierung der Versuchsbedingungen 48
2.2.7 Echtzeit-PCR-Analyse der Untereinheit 3 der NADH Dehydrogenase 50
2.2.7.1 Prinzip 50
2.2.7.2 Praktische Durchführung 52
2.2.8 Statistik 53
2.2.8.1 Statistik der semiquantitativen RT-PCR 53
2.2.8.2 Statistik der Echtzeit-PCR 53
3 Ergebnisse 54
3.1 Suche nach wandschubspannungsabhängig exprimierten Genen 54
3.1.1 Ausrichtung der Endothelzellen unter Wandschubspannung 54
3.1.2 Differentiell exprimierte Banden 55
3.1.3 Reamplifikation und Sequenzierung differentiell exprimierter Banden 58
3.1.4 Homologie zu publizierten Sequenzen 60
3.1.5 Von der LDL-induzierten mRNA abgeleitete Aminosäuresequenz 64
3.2 Bestätigung der wandschubspannungsabhängigen Expression
bestimmter Gene 65
3.2.1 Semiquantitative RT-PCR 65
LDL induzierte mRNA 66
Mikrotubulin assoziiertes Protein 4 67
Untereinheit 3 der NADH Dehydrogenase 68
30 kDA Protein 69
mRNA aus einer Teratokarzinomzelllinie 69
Protein GK 001 70
Untereinheit 7 der Cytochrom c Oxidase 71
3.2.2 Echtzeit-PCR der Untereinheit 3 der NADH Dehydrogenase 72
3.2.2.1 Effizienzbestimmung 72
3.2.2.2 exemplarische Zyklusprofile und Schmelzkurven 72
3.2.2.3 relative Expressionslevel der Untereinheit 3 der NADH DH 73
4
4 Diskussion 74
4.1 „differential display-RT-PCR" und Alternativen zur initialen Suche
differentiell exprimierter Gene 74
4.1.1 Überblick 74
4.1.2 Subtraktionshybridisierung 74
4.1.3 „differential display-RT-PCR" 75
4.1.4 Serielle Analyse der Genexpression 76
4.1.5 Microarray 77
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4.2 Verifizierung der differentiellen Expression identifizierter Gene 80
4.2.1 Analyse strömungsregulierter Gene mit semiquantitativer RT-PCR 80
4.2.2 Expressionssteigerung der „housekeeping" GAP DH durch Hypoxie und
Zytokine 80
4.2.3 Nachweis „illegitimer" Transkripte durch RT-PCR 81
4.2.4 Aggravierung von Unregelmäßigkeiten durch die Amplifikation 83
4.2.5 Echtzeit-PCR 84
4.2.6 „northem-blot" 84
4.2.7 Protein- und Funktionsebene 85
4.3 LDL- und wandschubspannungsmoduliertes Protein (LWMP) 86
4.3.1 Zuordnung der durch Wandschubspannung supprimierten Bande A zu einer
LDL-induzierten mRNA 86
4.3.2 Von der Primärstruktur abgeleitete Funktionen des LWMP 87
4.3.2.1 Prolin-reicher Abschnitt des LWMP 87
4.3.2.2 Zinkfingerdomänen des LWMP 88
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4.3.2.4 potentielle Zielgene des LWMP 92
4.3.3 Atherogenese und LWMP 99
4.3.3.1 LDL und Atherogenese 99
4.3.3.2 Polarität des Endothels 100
4.3.3.3 Mangan Superoxid Dismustase und VCAM-1: atheroskleroserelvante, potentielle Zielgene
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4.3.3.4 subendotheliale LDL-Retention durch Proteoglykane 103
4.3.4 Zusammenfassung und Ausblick: Mögliche Bedeutung der
wandschubspanungsregulierten Expression des LWMP 105
4.4 Untereinheit Vllc der Cytochrom c Oxidase (COX7c) 107
4.4.1 Zuordnung der durch Wandschubspannung supprimierten Bande AN zu der
COX7c 107
5
4.4.2 Die COX7c als funktionell relevante Untereinheit des Holoenzyms 108
4.4.3 Regulation der COX7c-Genexpression 109
4.4.4 Senkung der COX-Aktivität durch oxidative Modifikationen der COX7c und die
resultierende Freisetzung von Signalmolekülen 110
4.4.5 NO als Substrat der Cytochrom cOxidase 111
4.4.6 Supprimierung der Cytochrom c Oxidase durch NO 112
4.4.7 Pathologie der Interaktion von NO mit der Cytochrom cOxidase 114
4.4.8 Zusammenfassung und Ausblick: mögliche Bedeutung der
wandschubspannungsregulierten Expression derCOX7c 115
4.5 NADH Dehydrogenase (NADH DH) 117
4.6 Differentielle Genexpression durch Angiopoietin 2 118
Abkürzungsverzeichnis 120
Abbildungsverzeichnis 123
Tabellenverzeichnis 124
Literaturverzeichnis 125
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Erklärung an Eides Statt 162
Danksagung 163
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