Die neuronalen Proteolipide M6A und M6B: eine funktionale Analyse in vivo & in vitro
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Göttingen
Cuvillier
2002
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
VI
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VIII
I.
EINLEITUNG
1.
NEURONE
UND
AXONWACHSTUM
1
2.
OLIGODENDROZYTEN
UND
MYELIN
3
3.
DAS
PROTEOLIPID
PROTEIN
(PLP)
6
4.
MUTATIONEN
IM
PLP-GEN
UND
PLP-DEFIZIENTE
MAEUSE
7
5.
DIE
PROTEOLIPID-GENFAMILIE
9
6.
M6A
/
EMA
(EDGE
MEMBRANE
ANTIGEN)
11
7.
DAS
ZELLOBERFLAECHENPROTEIN
M6B
13
8.
ZIELSETZUNG
DER
DISSERTATION
16
II.
ERGEBNISSE
1.
LOKALISATION
VON
M6B
18
1.1
M6B-EXPRESSION
IN
PRIMAEREN
ZELLEN
18
1.1.1
M6B-EXPRESSION
IN
NEURONEN
19
1.1.2
M6B-EXPRESSION
WAEHREND
DER
OLIGODENDROZYTEN-DIFFERENZIERUNG
21
2.
EXPRESSIONSANALYSE
VON
M6B-ISOFBRMEN
23
2.1
EXPRESSIONSANALYSE
DER
M6B-RNA
23
2.1.1
NORTHERN
BLOT-ANALYSE
23
2.1.2
REGULIERTE
M6B-MRNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
GEHIRNENTWICKLUNG
DER
MAUS
24
2.1.3
EXPRESSION
DER
M6B-MRNA
WAEHREND
DER
OLIGODENDROZYTEN-DIFFERENZIERUNG
26
2.2
HERSTELLUNG
VON
ISOFBRMSPEZIFISCHEN
M6B-ANTISEREN
28
2.2.1
WESTERN
BLOT
ANALYSE
DER
SEREN
28
2.2.2
IMMUNZYTOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
SEREN
30
2.3
MOLEKULARE
KLONIERUNG
EUKARYONTISCHER
M6B-EXPRESSIONS
KONSTRUKTE
32
2.4
EXPRESSION
VON
M6B-ISOFORMEN
IN
HETEROLOGEN
ZELLEN
34
II
3.
AUSLAEUFERBILDUNG
NACH
M6B-UEBEREXPRESSION
35
3.1
ENDOGENE
EXPRESSION
VON
M6B
IN
PC12-ZELLEN
IN
AN
ODER
ABWESENHEIT
VON
NGF
36
3.2
UEBEREXPRESSION
VON
M6B
IN
PC12-ZELLEN
.
37
3.3
DIE
AUSBILDUNG
DER
AUSLAEUFER
IST
SPEZIFISCH
FUER
M6B
39
3.4
ZELLTYP
UNABHAENGIGE
AUSLAEUFERBILDUNG
40
3.5
ENTSTEHEN
DIE
FILOPODIEN
AUFGRUND
DER
AKTIVIERUNG
EINER
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE?
41
4.
ANALYSE
VON
M6A
UND
M6B-DEFIZIENTEN
MAEUSEN
46
4.1
ANALYSE
M6A-,
M6B
UND
M6A*M6B-DEFIZIENTER
NEURONEN
IN
VITRO
46
4.2
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
M6A
UND
M6A*M6B-DEFIZIENTER
MAEUSE
49
5.
INTERAKTION
VON
M6B
MIT
DEM
PROTEOLIPID
PROTEIN
50
5.1
TRANSPORT
VON
JIMPY-PLP
WIRD
DURCH
N-TERMINALE
MODIFIKATIONEN
BEEINFLUSST
52
5.2
EINFUEHRUNG
VON
MUTATIONEN
IM
M6B-PROTEIN
53
III.
DISKUSSION
1.
FUNKTION
VON
PROTEOLIPIDEN:
EINE
UEBERSICHT
55
2.
AUSLAEUFERBILDUNG
NACH
M6B-UEBEREXPRESSION
57
2.1
ENDOGENE
M6B-EXPRESSION
IN
PC12-ZELLEN
57
2.2
ZELLULAERE
UEBEREXPRESSION
INDUZIERT
DIE
BILDUNG
VON
AUSLAEUFERN
58
2.2.1
NGF
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
M6B-INDUZIERTE
AUSLAEUFERBILDUNG
58
2.2.2
M6B-BEDINGTE
AUSLAEUFERBILDUNG
IST
UNABHAENGIG
VON
DER
UEBEREXPRIMIERTEN
M6B-ISOFORM
59
2.2.3
AUSLAEUFERBILDUNG
DURCH
M6B
IST
AUCH
IN
PRIMAEREN
HIPPOCAMPUS-NEURONEN
ZU
BEOBACHTEN
60
2.2.4
DIE
AUSLAEUFERBILDUNG
IST
SPEZIFISCH
FUER
M6B
61
2.3
HANDELT
ES
SICH
BEI
DIESEN
INDUZIERTEN
AUSLAEUFERN
UM
FILOPODIEN?
61
2.4
MOEGLICHE
MECHANISMEN
DER
AUSLAEUFERENTSTEHUNG
63
3.
ANALYSE
M6A*M6B-DEFIZIENTER
MAEUSE
66
3.1
MOTORISCHE
FAEHIGKEITEN
DOPPELDEFIZIENTER
TIERE
NEHMEN
IM
ALTER
AB
68
4./P-PLP
ALS
MITTEL
UM
DIE
INTERAKTION
ZWISCHEN
PROTEOLIPIDEN
ZU
ZEIGEN
70
5.
DER
TRANSPORT
VON
JP-PLP
WIRD
DURCH
N-TERMINALE
MODIFIKATIONEN
BEEINFLUSST
71
III
IV.
MATERIAL
1.
CHEMIKALIEN
74
1.1
ALLGEMEINE
CHEMIKALIEN
74
1.2
ZELLKULTUR-CHEMIKALIEN
74
2.
VERBRAUCHSMATERIAL
75
2.1
ALLGEMEINES
VERBRAUCHSMATERIAL
75
2.2
ZELLKULTUR-VERBRAUCHSMATERIAL
76
3.
GERAETE
76
4.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
77
4.1
LOESUNGEN
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
77
4.2
LOESUNGEN
FUER
RNA-PRAEPARATIONEN
UND
NOTHEM
BLOT
HYBRIDISIERUNG
77
4.3
SONSTIGE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
78
5.
MEDIEN
79
5.1
MEDIEN
ZUR
BAKTERIENKULTIVIERUNG
79
5.2
ZELLKULTURMEDIEN
79
6.
IMMUNZYTOCHEMIE
82
7.
PROTEINBIOCHEMIE
82
8.
HISTOCHEMIE
84
9.
REAKTIONSKOMPLETTAUSSTATTUNGEN
85
10.
ENZYME
85
11.
ANTIKOERPER
86
12.
TIERE,
ZELLINIEN,
BAKTERIEN
UND
VEKTOREN
86
12.1
TIERE
86
12.2
ZELLINIEN
87
12.3
BAKTERIENSTAEMME
87
12.4
VEKTOREN
UND
KONSTRUKTE
87
13.
GROESSENMARKER
FUER
DNA
UND
PROTEINE
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
87
14.
RADIOAKTIV
MARKIERTE
OLIGONUKLEOTIDE
88
15.
OLIGONUKLEOTIDE
88
16.
HARD-UND
SOFTWARE
89
V.
METHODEN
1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
90
1.1
PRAEPARATION
UND
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
90
1.1.1
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
90
1.1.2
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
BAKTERIEN
90
1.1.3
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
MAUSSCHWANZGEWEBE
90
IV
1.1.4
PHENOL/CHLOROFORM-PRAEPARATION
VON
RNA
AUS
GEWEBEN
90
1.1.5
PRAEPARATION
VON
RNA
AUS
GEWEBEN
91
1.1.6
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
91
1.1.7
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNA
92
1.1.8
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNA
92
1.1.9
DENATURIERENDE
FORMALDEHYD-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
92
1.1.10
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
93
1.1.1
0A
ELUTION
VON
DNA
MIT
NA45
ANIONENAUSTAUSCHERPAPIER
93
1.1.1
0B
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
93
1.1.11
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
93
1.1.12
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UND
GROESSENMARKEM
(KINASIEREN)
93
1.1.13
NORTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
94
1.2
METHODEN
ZUR
MOLEKULAREN
KLONIERUNG
94
1.2.1
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
94
1.2.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOREN
94
1.2.3
GENERIERUNG
VON
BLUNT-ENDEN
94
1.2.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
95
1.2.5
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
95
1.2.6
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
95
1.2.7
BLAU-WEISS-SELEKTION
AUF
X-GAL/IPTG-PLATTEN
95
1.3
HERSTELLUNG
VON
CDNA
95
1.4
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
96
1.4.1
NICHT-QUANTITATIVE
PCRS
96
1.4.2
SEMIQUANTITATIVE
RADIOAKTIVE
PCRS
96
2.
ZELLKULTUR-METHODEN
97
2.1
KULTIVIERUNG
VERSCHIEDENER
ZELLINIEN
97
2.1.1
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
97
2.2
EKTOPISCHE
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
97
2.2.1
KALZIUM-PHOSPHAT-TRANSFEKTION
VON
HELA-ZELLEN
98
2.2.2
ELEKTROPORATION
VON
KULTIVIERTEN
ZELLEN
98
2.2.3
SS-GALAKTOSIDASE-TEST
99
2.3
PRAEPARATION
VON
PRIMAEREN
OLIGODENDROZYTEN
UND
KORTIKALEN
ASTROZYTEN
99
2.4
PRAEPARATION
VON
HIPPOCAMPUS-NEURONEN
DER
MAUS
BZW.
DER
RATTE
100
3.
IMMUNCYTOCHEMIE
100
3.1
IMMUNFAERBUNG
100
3.1.1
LEBENDFAERBUNG
VON
ZELLEN
100
3.1.2
FAERBUNG
VON
PERMEABILISIERTEN
ZELLEN
100
4.
METHODEN
ZUR
PROTEINANALYSE
101
4.1
HERSTELLUNG
VON
ZELL
UND
GEWEBEEXTRAKTEN
101
V
4.1.1
MEMBRANPRAEPARATION
101
4.1.2
GESAMTZELLEXTRAKTE
101
4.1.3
PROTEINBESTIMMUNG
101
4.1.4
TCA-PRAEZIPITATION
102
4.2
PROTEINANALYSE
102
4.2.1
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
102
4.2.2
WESTERN
BLOT
ANALYSE
102
4.2.3
COOMASSIEFAERBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
103
4.3
PATHDETECT
TRANS
REPORTING
SYSTEM
STRATAGENE
103
4.4
IN
VITRO
KINASEN-TEST
103
5.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
104
5.1
KOPPLUNG
DES
ANTIGENPEPTIDS
104
5.2
IMMUNISIERUNG
104
5.3
GEWINNUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
IMMUNSEREN
105
5.4
ANALYSE
DER
ANTIKOERPERBINDUNG
(ELISA)
105
5.5
AUFREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
PROTEIN
A-SEPHAROSE
105
6.
HISTOLOGISCHE
UND
IMMUNHISTOCHEMISCHE
METHODEN
106
6.1
GANZKOERPERFIXIERUNG
VON
MAEUSEN
DURCH
PERFUSION
106
6.2
IMMUNHISTOCHEMIE
AUF
VIBRATOMSCHNITTEN
106
7.
VERHALTENSBIOLOGIE:
ROTAROD-TEST
106
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
107
VII.
LITERATUR
108 |
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