Verfügbarkeit: Beteiligung der Mikroprozessorkomplex-Untereinheit DGCR8 an der adaptiven Immunantwort und Keimzentrumsreaktion

Beteiligung der Mikroprozessorkomplex-Untereinheit DGCR8 an der adaptiven Immunantwort und Keimzentrumsreaktion:

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Daum, Patrick 1985- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Erlangen ; Nürnberg 2018
Schlagworte:	miRNS B-Lymphozyt Hochschulschrift
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Beschreibung:	153 Seiten Illustrationen, Diagramme 21 cm

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adam_text	1. ZUSAMMENFASSUNG.................................................................................................................. 1 2. SUMMARY................................................................................................................................... 3 3. EINLEITUNG.................................................................................................................................. 4 3.1 REIFUNG UND DIFFERENZIERUNG VON FOLLIKULAEREN UND MARGINALZONEN-B-ZELLEN ......................... 4 3.1.1 ZENTRALE B-ZELLREIFUNG IM KNOCHENMARK.................................................................................... 5 3.1.2 TRANSITIONALE B-ZELLEN.................................................................................................................6 3.1.3 ENTSTEHUNG REIFER B-ZELLEN UND INITIALE ANTIGENAKTIVIERUNG......................................................6 3.1.4 KEIMZENTRUMSREAKTION...............................................................................................................8 3.1.5 GEDAECHTNIS-B-ZELLEN................................................................................................................. 11 3.1.6 GEDAECHTNIS-B-ZELLEN................................................................................................................. 12 3.2 B-L-ZELLEN................................................................................................................................. 14 3.2.1 ENTWICKLUNG DER B-L-ZELLEN.......................................................................................................15 3.2.2 AUFGABENSPEKTRUM DER B-L-ZELLEN .......................................................................................... 15 3.3 MICRORIMAS - FUNKTION & AUFGABEN........................................................................................ 17 3.3.1 BIOGENESEWEG DER MIRNAS.......................................................................................................17 3.3.2 BEDEUTUNG DES MIRNA-PROZESSIERUNGSAPPARATS..................................................................... 19 3.3.3 MIRNAS ALS REGULATOREN DER B-ZELLENTWICKLUNG & PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG ....................... 20 4. ZIELSETZUNG DER A RB E IT..........................................................................................................23 5. ERGEBNISSE............................................................................................................................... 24 5.1 UNTERSUCHUNGEN DES EINFLUSSES EINER KONDITIONALEN DGCRB-DELETION AUF DIE B-ZELLREIFUNG UND -AKTIVIERUNG.....................................................................................................................................24 5.1.1 ETABLIERUNG EINES MAUSMODELLS ZUR CD23CRE-VERMITTELTEN DELETION VON DGCR8..................24 5.1.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR B-ZELLREIFUNG IN NICHT-IMMUNISIERTEN CD23CRE-DGCR8FLOXED-TIEREN ..... 26 5.1.3 UNTERSUCHUNGEN ZUM EINFLUSS EINER KONDITIONALEN DGCR8-DELETION AUF DIE HUMORALE T-ZELL- ABHAENGIGE IMMUNANTWORT.......................................................................................................................38 5.1.4 IN VITRO ANALYSEN REIFER MILZ-B-ZELLEN AUS DGCR8-DEFIZIENTEN TIEREN .................................... 43 5.2 IN VITRO UNTERSUCHUNGEN ZUM EINFLUSS DER MIR-29 AUF DIE AKTIVIERUNG UND DIFFERENZIERUNG MURINER B-ZELLEN........................................................................................................................................48 5.2.1 EXPRESSIONSPROFIL DER MIR-29 IN MURINEN B-ZELLDIFFERENZIERUNGSSTADIEN ............................... 48 5.2.2 KONSTRUKTION EINES MIR-29-EXPRESSIONSVEKTORS ...................................................................... 49 5.2.3 BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG POTENTIELLER ZIELGENE MITTELS DUALEM LUZIFERASE-ASSAY ......... 51 5.2.4 FUNKTIONALE IN VITRO ANALYSEN DER MIR-29 IN PRIMAEREN LPS-BLASTEN ....................................... 54 6. DISKUSSION................................................................................................................................ 66 6.1 EINE CD23CRE-VERMITTELTE DELETION VON DGCR8 KOMPROMITTIERT DIE REIFE POPULATION DER B- 2-ZELLEN IN DER M ILZ................................................................................................................................... 66 6.1.1 EIN KEIMZENTRUMSDEFEKT IN DGCR8-DEFIZIENTEN TIEREN BEEINTRAECHTIGT DIE BILDUNG VON LGG+- ZELLEN ....................................................................................................................................................67 6.1.2 DIE BILDUNG EINER AFFINEN SPEZIFISCHEN IGM-ANTWORT, UNABHAENGIG VOM KEIMZENTRUM . ......... 69 6.1.3 EINE MOEGLICHE BETEILIGUNG DER B-L-ZELLEN AN DER ADAPTIVEN HUMORALEN IMM UNITAET..............70 6.1.4 EINE GEDAECHTNISBILDUNG MIT SPEZIFISCHEM IGM UNABHAENGIG VOM KEIMZENTRUM .................... 70 6.1.5 DIE BILDUNG VON LGM+-PLASMAZELLEN IN DER CD23CRE-DGCR8FLOXED-MAUS .................................. 71 6.1.6 DIE BILDUNG VON PLASMAZELLEN MIT KLASSENGEWECHSELTEM LG-LSOTYP IN DER CD23CRE- DGCR8FLOXED-MAUS....................................................................................................................................... 73 6.2 DIE UNTERSTUETZENDE ROLLE DER MIR-29 AN DER PLASMABLAST-/PLASMAZELL-ENTWICKLUNG..........75 6.2.1 DIE ROLLE DER MIR-29 IN DER PLASMAZELLENTWICKLUNG................................................................ 76 6.2.2 DIE MIR-29 ALS MOEGLICHER INDUKTOR DER IL-6-SYNTHESE............................................................. 77 7. M ATERIAL UND M E TH O D E N ...................................................................................................... 82 7.1 VERWENDETE ANALYSESOFTWARE................................................................................................. 82 7.2 ANALYSE- & SONSTIGE GERAETE..................................................................................................... 82 7.3 ANALYSE- & SONSTIGE GERAETE..................................................................................................... 82 7.4 VERWENDETE KITS.......................................................................................................................83 7.5 VERBRAUCHSMATERIALEN............................................................................................................. 83 7.5.1 PLASTIKWAREN.............................................................................................................................. 83 7.5.2 KANUELEN...................................................................................................................................... 85 7.5.3 GLASWAREN.................................................................................................................................. 85 7.5.4 PAPIERE. 85 7.6 SAEUGETIERZELLLINIEN................................................................................................................. 85 7.6.1 VERWENDETE SAEUGERZELLLINIEN.................................................................................................. 85 7.6.2 NAEHRMEDIEN & ZUSAETZE FUER ZELLLINIEN.......................................................................................85 7.6.3 ZUSAETZE FUER IN VITRO STIMULATION PRIMAERER MILZ-B-ZELLEN......................................................... 86 7.6.4 ZUSAMMENSETZUNG NAEHRMEDIEN FUER ZELLLINIEN ....................................................................... 86 7.6.5 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLLINIEN............................................................................................ 87 7.6.6 AUFTAUEN KRYOKONSERVIERTER ZELLEN.........................................................................................87 7.7 BAKTERIEN................................................................................................................................. 87 7.7.1 BAKTERIENSTAEMME....................................................................................................................87 7.7.2 NAEHRMEDIEN FUER BAKTERIEN....................................................................................................... 87 7.7.3 ERZEUGUNG ELEKTROKOMPETENTER E. COII GENEHOGS ................................................................ 88 7.7.4 TRANSFORMATION VON E. COLI MITTELS ELEKTROPORATION .............................................................. 88 7.7.5 TRANSFORMATION HITZEKOMPETENTER DH5A E. C O LI ....... ............................................................ 89 7.8 PRAEPARATION UND ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN.......................................................................89 7.8.1 ISOLATION VON GENOMISCHER DNA UND GESAMT-RNA AUS EINER PROBE..................................... 89 7.8.2 AUFREINIGUNG VON RNA ZUR DURCHFUEHRUNG EINER QUANTITATIVEN REAL TIME PCR......................89 7.8.3 QUANTITATIVE ANALYSE VON GENTRANSKRIPTEN MITTELS RT-PCR.................................................. 89 7.8.4 ERSTELLEN VON TRANSKRIPTSPEZIFISCHEN PRIMERN FUER DIE QUANTITATIVE RT-PCR........................... 90 7.8.5 RT-PCR ZUR QUANTIFIZIERUNG VON REIFEN MICRORNAS................................................................90 7.9 PRAEPARATION MURINER OHR- BZW. SCHWANZBIOPSIEN ZUR ANALYSE GENOMISCHER DNA............91 7.9.1 GENOTYPISIERUNGS-PCR............................................................................................................. 91 7.9.1.1 DGCR8.......................................................................................................................................92 7.9.1.2 CD23CRE-TRANSGEN (ORIGINAL PRIMER-SET)................................................................................. 92 7.9.1.3 CD23CRE-TRANSGEN (MODIFIZIERTES PRIMER-SET)....................................................................... 92 7.9.1.4 TLR-7.........................................................................................................................................93 7.9.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA................................................................................................... 93 7.9.3 PRAEPARATIVER UND ANALYTISCHER RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA. 93 7.9.4 PRAEPARATION RESTRIKTIONSVERDAUTER FRAGMENTE AUS AGAROSEGEL ............................................. 7.9.5 ANALYTISCHE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN.............................................93 7.9.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN ..................................................................... 94 7.9.7 LIGATION VON DNA.......................................................................................................................94 7.9.8 GEWINNUNG GENOMISCHER DNA AUS ZELLLINIEN...........................................................................94 7.10 TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN.........................................................................................95 7.11 RETROVIRALE INFEKTION PRIMAERER MURINER B-ZELLEN AUS DER M ILZ.............................................96 7.12 PRAEPARATION PRIMAERER MAUSZELLEN EX VIVO...............................................................................96 7.12.1 ISOLATION NAIVER PRIMAERER B-ZELLEN AUS DER MILZ VON MAEUSEN.................................................96 7.12.2 KULTIVIERUNG VON MURINEN B-ZELLEN IN VITRO...............................................................................97 7.12.3 ISOLATION VON ZELLEN AUS DEM KNOCHENMARK VON MAEUSEN.......................................................97 7.12.4 PRAEPARATION VON INGUINALEN UND MESENTERISCHEN LYMPHKNOTEN UND PEYER SCHEN PLAQUES. 97 7.12.5 ISOLATION VON ZELLEN AUS DEM B LU T............................................................................................ 97 7.12.6 GEWINNUNG VON SERUM AUS PERIPHEREM B LU T .......................................................................... 98 7.12.7 ISOLATION PERITONEALER ZELLEN MITTELS LAVAGE............................................................................98 7.13 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN.........................................................................................98 7.13.1 VERWENDETE ANTIKOERPER............................................................................................................ 98 7.13.2 ALLGEMEINE VORGEHENSWEISE BEI DER AUSWERTUNG DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER ANALYSEN .... 100 7.13.3 FLUORESZENZFAERBUNGEN VON MURINEN ZELLPOPULATION FUER DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN.... ................................................................................................................................................ 100 7.13.4 FLUORESZENZFAERBUNG INTRAZELLULAERER MOLEKUELE FUER ANALYSE MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETER.... 102 7.13.5 ZELLZAHLBESTIMMUNG IM DURCHFLUSSZYTOMETER MITTELS COUNTING BEADS ................................ 102 7.13.6 VIABILITAETSBESTIMMUNG VON ZELLEN MITTELS FLUORESZENZFAERBUNG MIT ANNEXINV UND P I ....... 103 7.13.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE SORTIERUNG VON B-ZELL-SUBPOPULATIONEN ...................................... 103 7.14 IMMUNHISTOLOGISCHE FLUORESZENZFAERBUNG VON KRYOTOMSCHNITTEN DER M ILZ ....................... 103 7.15 ZELLZAHLBESTIMMUNG................................................................................................................105 7.15.1 NEUBAUER-ZAEHLKAMMER.......................................................................................................... 105 7.15.2 COUNTING BEADS (FACS)............................................................................................................105 7.16 VERWENDETE MAUSSTAEMME 106 7.17 IMMUNISIERUNG VON VERSUCHSTIEREN .................................................................................... 106 7.17.1 INTRAPERITONEALE IMMUNISIERUNG MIT TNP-KLH..................................................................... 107 7.17.2 INTRAPERITONEALE IMMUNISIERUNG MIT SCHAFSERYTHROZYTEN....................................................107 7.17.3 INTRAPERITONEALE IMMUNISIERUNG MIT TNP-FICOLL................................................................... 107 7.17.4 IMMUNISIERUNGSSCHEMATA.................................................................................................... 107 7.18 DURCHFUEHRUNG DES DUALEN LUZIFERASE-ASSAYS......................................................................108 7.18.1 KONSTRUKTION VON VEKTOREN FUER DEN DUALEN LUCIFERASE ASSAY ZIEL-MRNA VORHERSAGE VON MIRNAS MITTELS IN SILICO ANALYSEN..........................................................................................................108 7.18.2 PRIMERDESIGN DER 3 -UTR-KONSTRUKTE FUER DEN DUALEN LUCIFERASE ASSAY..............................108 7.18.3 KLONIERUNG DER LUCIFERASEVEKTOREN......................................................................................110 7.18.4 TRANSFEKTION DER LUZIFERASE- UND MIRNA-VEKTOREN ............................................................ 110 7.19 ANALYSEN ANTIKOERPER-SEZERNIERENDER ZELLEN MITTELS ELISPOT ............................................ 111 7.20 BESTIMMUNG VON ANTIKOERPERKONZENTRATIONEN MITTELS ELISA ............................................ 114 7.20.1 AUSWERTUNG ELISA-DATEN.......................................................................................................116 7.21 ANALYSE SEKRETIERTER PROTEINE AUS SEREN UND ZELLKULTURUEBERSTAENDE ................................ 117 7.21.1 BESTIMMUNG VON IGM BZW. IGG AUS ZELLKULTURUEBERSTAENDEN MITTELS ELISA ........................... 117 7.21.2 BESTIMMUNG VON IL-6- BZW. IL-10-KONZENTRATION AUS ZELLKULTURUEBERSTAENDEN MITTELS ELISA 117 7.22 VERWENDETE VEKTOREN..........................................................................................................117 7.22.1 KLONIERUNG DER MIRNA-EXPRESSIONSVEKTOREN....................................................................... 118 8. ABKUERZUNGEN....................................................................................................................... 120 9. LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................................................... 124 10. ABBILDUNGS- & TABELLENVERZEICHNIS................................................................................143 11. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................... 146 12. PUBLIKATIONSLISTE.................................................................................................................150 13. LEBENSLAUF...........................................................................................................................151 DANKSAGUNG......................................................................................................................................... 152 ERKLAERUNG. 154
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