Untersuchungen an zwei ungewöhnlichen mitochondrialen tRNAs in Beuteltieren:
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1997
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INHALT
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
EINLEITUNG
1.
DAS
MITOCHONDRIUM
DER
SAEUGETIERE
.
2
1.1
MITOCHONDRIEN
SIND
AUTARK
UND
DOCH
ABHAENGIG
.
2
1.2
DAS
MITOCHONDRIALE
GENOM
DER
SAEUGETIERE
.
3
1.3
DIE
EVOLUTION
MITOCHONDRIALER
GENE
.
5
2.
TRANSFER
RNAS
UND
DER
GENETISCHE
CODE
IN
MITOCHONDRIEN
.
6
2.1
TRANSKRIPTION
UND
PROZESSIERUNG
.
6
2.2
DIE
STRUKTUR
MITOCHONDRIALER
TRNAS
.
7
2.3
DIE
IDENTITAET
UND
AMINOACYLIERUNG
.
9
2.4
MODIFIZIERTE
BASEN
.
10
2.5
DER
GENETISCHE
CODE
UND
DIE
CODON-ERKENNUNG
.
11
3.
RNA
EDITING
.
12
3.1
EIN
UEBERBLICK
.
13
3.2
TRNA
EDITING
IN
MITOCHONDRIEN
.
15
4.
RNA
IMPORT
IN
MITOCHONDRIEN
.
17
MATERIAL
UND
METHODEN
I.
MATERIAL
1.
FEINCHEMIKALIEN
.
20
2.
PUFFER
.
20
3.
ENZYME
.
20
4.
NUKLEOTIDE
.
20
5.
RADIOCHEMIKALIEN
.
21
6
OLIGONUKLEOTIDE
.
21
7
VEKTOREN
.
22
8.
MEDIEN
.
22
9.
SEREN
UND
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
22
10
BAKTERIENSTAEMME
.
22
11
GEWEBE,
DNA
PROBEN
UND
ZELLKULTUR
.
23
II.
METHODEN
1.
SYNTHESE
VON
DNA
.
24
1
1
OLIGONUKLEOTIDE
.
24
1
2
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
-
PCR
.
24
1.3
CDNA
SYNTHESE
.
24
1.4
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
25
2.
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
25
2.1
DNA
ISOLIERUNG
AUS
GEWEBE
.
25
2.2
PRAEPARATIVE
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
25
2.3
REINIGUNG
VON
32
P-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
26
2.4
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
26
2.5
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
.
26
3.
ANALYSE
VON
DNA
.
26
II
3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
26
3.2
GELELEKTROPHORETISCHE
ANALYSE
.
27
3.3
RESTRIKTIONSANALYSE
.
27
3.4
DNA
LIGATION
.
27
3
5
DNA-SEQUENZIERUNG
.
27
3.6
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
(UND
RNA)
.
27
3.7
5
'
MARKIERUNG
(KINASIERUNG)
MIT
[Y
"
P]-ATP
.
27
3
8
KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
.
28
3.9
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
28
3.10
ALIGNMENT
VON
DNA
.
28
4.
SYNTHESE
VON
RNA
.
28
4.1
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
MIT
T7-RNA-POLYMERASE
.
28
5.
ISOLIERUNG
VON
RNA
.
29
5.1
GUANIDINIUM-THIOCYANAT-METHODE
.
29
5
2
ISOLIERUNG
VON
RNA
DURCH
PHENOL-EXTRAKTION
.
29
5.3
ISOLIERUNG
SPEZIFISCHER
MITOCHONDRIALER
TRNAS
-
AFFINITAETSREINIGUNG.
29
6.
ANALYSE
VON
RNA
.
30
6.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DURCH
UV-SPEKTROSKOPIE
.
30
6
2
GELELEKTROPHORETISCHE
ANALYSE
.
30
6
3
3'
ENDMARKIERUNG
VON
RNA
MIT
[A
M
P]-PCP
.
30
6.4
EINZELNUKLEOTID-SEQUENZIERUNG
MIT
REVERSER
TRANSKRIPTASE
.
30
6,5
RNA
SEQUENZIERUNG
MIT
REVERSER
TRANSKRIPTASE
.
31
6.6
YYPOSTLABELING
"
SEQUENZIERUNG
VON
TRNAS
.
31
6
7
BASENKATALYSIERTE
UMLAGERUNG
VON
M'A
ZU
M
6
A
.
32
6
8
TRNA
ZIRKULARISIERUNG
.
32
6.9
DOT
BLOT
ANALYSE
VON
RNA
.
32
6.10
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
.
33
6.11
QUANTITATIVE
ANALYSEN
.
33
7.
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
GEWEBE
.
33
7.1
ANREICHERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
DURCH
DIFFERENTIELLE
ZENTRIFUGATION.
33
7.2
MITOCHONDRIEN
REINIGUNG
DURCH
SUCROSEGRADIENT-ULTRAZENTRIFUGATION.33
7.3
DIGITONIN
UND
NUKLEASE
BEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
34
7.4
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
NACH
BRADFORD
.
34
8
ZELLKULTUR
.
34
9.
PROGRAMME
FUER
DIE
PHYLOGENETISCHEN
REKONSTRUKTIONEN
.
35
ERGEBNISSE
I.
DIE
MITOCHONDRIALE
TRNA
A,P
IN
BEUTELTIEREN
.
36
1.
DAS
TRNA
A,P
GEN
(GCC)
IST
KONSERVIERT
.
36
2.
GIBT
ES
EINE
KERNKOPIE
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
A,P
IN
BEUTELTIEREN?
.
38
3.
WANN
WIRD
EDITIERT?
.
41
4.
WELCHE
BASE
ENTSTEHT
DURCH
RNA
EDITING?
.
43
4.1
ISOLIERUNG
HOCHREINER
MITOCHONDRIALER
TRNA
A
'
P
.
44
4.2
QUANTIFIZIERUNG
DES
TRNA
EDITINGS
IN
DEN
ISOFORMEN
DER
TRNA
ASP
.
46
III
4
3
YYPOSTLABELING
"
-SEQUENZIERUNG
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
ASP
.
48
4
4
DIE
ABFOLGE
VON
MODIFIKATION
UND
RNA
EDITING
BEI
DER
REIFUNG
DER
TRNA
ASP
.
53
II.
WELCHE
TRNA
HAT
EINE
LYSIN-IDENTITAET
IN
BEUTELTIER
MITOCHONDRIEN?
.
55
1.
DAS
MITOCHONDRIALE
LYSYL-TRNA
GEN
IN
BEUTELTIEREN
.
55
1.1
DIE
SEKUNDAERSTRUKTUR
UND
DAS
ANTICODON
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
LY
'
.
57
1.2
EIN
MITOCHONDRIALES
PSEUDOGEN?
.
60
2.
GIBT
ES
EIN
WEITERES
GEN
FUER
EINE
MITOCHONDRIALE
TRNA
L
*
'
IN
BEUTELTIEREN?
.
63
3.
WIRD
EINE
CYTOPLASMATISCHE
TRNA
LY
*
IN
DIE
MITOCHONDRIEN
VON
BEUTELTIEREN
IMPORTIERT?
.
64
3.1
DIE
ISOAKZEPTOREN
DER
CYTOPLASMATISCHEN
TRNA
LY
'
BEI
SAEUGETIEREN
.
64
3.2
ANFORDERUNGEN
AN
EINEN
IMPORT-NACHWEIS
.
66
3.3
NORTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNGEN
ZEIGEN
KEINEN
TRNA
IMPORT
.
68
4.
DAS
TRANSKRIPT
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
LY
*
IN
BEUTELTIEREN
.
72
4.1
KANN
RNA
EDITING
EINE
FUER
PLAZENTATIERE
YYTYPISCHE
"
MT.
TRNA
LYS
KREIEREN?
.
73
4.2
WIRD
DIE
MITOCHONDRIAL
CODIERTE
TRNA
LYS
IN
BEUTELTIEREN
EDITIERT?
.
74
4
3
PROZESSIERUNG
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
LYS
IN
BEUTELTIEREN
.
77
5.
KANN
EINE
ANDERE
MITOCHONDRIALE
TRNA
EINE
LYSIN-IDENTITAET
ERHALTEN?
.
79
III.
WARUM
BEUTELTIERE?
-
EIN
EXKURS
IN
DIE
EVOLUTION
DER
SAEUGETIERE
.
82
1.
EIN
REPETITIVES
ELEMENT
IM
NUKLEAEREN
GENOM
DES
OPOSSUMS
.
83
2.
EIN
LINE-1
ELEMENT
IM
GENOM
VON
OPOSSUM
.
86
3.
DIE
VERBREITUNG
VON
LINE-1
ELEMENTEN
.
88
4.
DIE
PHYLOGENETISCHE
VERWANDTSCHAFT
DER
SAEUGETIERE
ANHAND
DER
SEQUENZ
VON
LINE-1
ELEMENTEN
.
90
DISKUSSION
I.
RNA
EDITING
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
A,P
.
94
1.
DER
EVOLUTIVE
URSPRUNG
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
A,P(GCC)
.
95
2.
EINE
MOEGLICHE
FUNKTION
DER
NICHT-EDITIERTEN
TRNA
A,P(GCCI
.
96
3.
DIE
REIFUNG
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
A,P
IN
BEUTELTIEREN
.
96
4.
DIE
IDENTITAET
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
A,P
.
100
5.
EIN
MODELL
DER
TRNA
A,P
FUNKTION
IN
BEUTELTIER-MITOCHONDRIEN
.
102
6.
DER
RNA
EDITING
MECHANISMUS
.
103
IV
II.
DIE
MITOCHONDRIALE
LYSIN-TRNA
.
106
1.
LYSIN-CODONS
IN
SAEUGETIER-MITOCHONDRIEN
.
106
2.
DIE
MITOCHONDRIALE
TRNA
LY
IN
SAEUGETIEREN
.
107
3.
DAS
GEN
DER
MT.
TRNA'
LY
*
'
IN
BEUTELTIEREN
CODIERT
KEINE
KONVENTIONELLE
LYSIN-TRNA
.
108
4.
DAS
MITOCHONDRIALE
TRNA
'
LY
"
GEN
DER
BEUTELTIEREN
-
EIN
PSEUDOGEN?
.
112
5.
EINE
FUNKTION
DER
MITOCHONDRIALEN
TRNA
'
LY
'
'
DER
BEUTELTIERE
.
113
III.
WOHER
ERHALTEN
BEUTELTIERE
EINE
MITOCHONDRIALE
LYSYL-TRNA?.
.115
1.
EINE
CYTOPLASMATISCHE
TRNA
LY
'
WIRD
NICHT
IMPORTIERT
.
116
2.
RNA
EDITING
UND/ODER
BASENMODIFIKATION
-
DIE
LOESUNG?
.
118
3.
AUSBLICK
.
121
LITERATUR
.
123
ABKUERZUNGEN
.
138 |
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