Katabolismus des Molybdän-Cofaktors: Identifikation der endogenen Thiopterin-Methyltransferase
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2014
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| adam_text | Titel: Katabolismus des Molybdän-Cofaktors
Autor: Csaszar, Julika
Jahr: 2014
1 EINLEITUNG 1
1.1 Pterine - Struktur, biologische Bedeutung und Metabolismus 1
1.1.1 Chemische Struktur der Pterine 1
1.1.2 Biologische Bedeutung der Pterine 2
1.1.3 Metabolismus der Pterine 3
1.2 Molybdän und der Molybdän-Cofaktor (Moco) 5
1.3 Metabolismus von Moco 7
1.3.1 Anabolismus - Moco-Biosynthese 7
1.3.2 Katabolismus - Urothion als Degradationsprodukt von Moco 10
1.4 Moco-abhängige Enzyme 13
1.5 Moco-Defizienz 15
1.6 DieThiopurin-S-Methyltransferase 18
1.5.1 Die klinische Bedeutung der TPMT in der Pharmakologie 19
1.6.1.1 Der Einfluss der TPMT auf die Thiopurin-Behandlung verschiedener Krankheiten
19
1.6.1.2 TPMT-Defizienz-Auswirkungen und genetische Hintergründe 21
1.6.2 Empfehlungen für Thiopurin-behandelte Krankheiten und Diagnose der
TPMT-Defizienz 24
1.6.2.1 Thiopurin-Arzneien - Dosis, Nebenwirkungen und Richtlinien 24
1.6.2.2 Bestimmung des TPMT-Status - Genotypisierung und Phänotypisierung 25
1.7 Ziel dieser Arbeit 27
2 ERGEBNISSE 28
2.1 Urothionaufreinigung aus Urin 28
2.2 Verifizierung der Identität von Urothion 29
2.2.1 Massenspektrometrie 29
2.2.2 Analytische Dünnschichtchromatographie 32
2.2.3 pH-abhängige UV/Vis-Spektrometrie 33
2.3 Die Urothion-Synthese 34
2.3.1 Möglicher Abbauweg des Molybdän-Cofaktors 34
2.3.2 Entwicklung und Etablierung der S-Adenosylmethionin-abhängigen in vitro Synthese
von Urothion 36
2.4 Anreicherung und Identifizierung der Urothion-Syntheseaktivität 42
2.4.1 Ammoniumsulfatpräzipitation 42
2.4.2 Anionenaustauschchromatographie 43
2.4.3 Größenausschlusschromatographie 44
2.4.4 Identifizierung der Enzyme durch Peptid-Massen-Fingerprint-Analyse 46
2.5 Rekombinante Expression und funktionelle Charakterisierung der
Thiopurin S-Methyltransferase 48
2.5.1 Die TPMT-katalysierte Thiopterin-Methylierung 49
2.5.2 Der Oxidationszustand von Thiopterin als dem Substrat der TPMT 50
2.5.3 Reaktionskinetik der TPMT mit 6-Mercaptopurin und MPT 53
2.5.4 Identifikation des Intermedials Jukathion 54
2.6 TPMT-abhängige in vitro Urothion-Synthese in Leberextrakten 60
2.7 Der in vivo Nachweis - MPT als endogenes Substrat der TPMT 61
2.7.1 Untersuchung von Leberproben von Wildtyp und TPMT -Knockout-Mäusen 61
2.7.2 Urothion-Synthese in humanen Leber- und Erythrozytenlysaten 64
2.7.2.1 Urothion-Reaktionskinetik von humanen Leber- und Erythrozytenlysaten 64
2.7.2.2 Identifikation des TPMT-Genotyps von humanen Leber- und Erythrozytenlysaten
anhand der in vitro Urothion-Synthese 67
2.7.3 Quantifizierung von Urothion in Urinproben von TPMT-Patienten 69
3 DISKUSSION 72
3.1 Der Moco-Katabolismus 72
3.2 Voraussetzungen für die Identifikation Urothion-syntlietisierender Enzyme 72
3.3 Die Substratquelle in der in vitro Urothion-Synthese 73
3.4 Die Suche nach den Urothion-synthetisierenden Enzymen 74
3.4.1 Die Applikation der AP in der in vitro Urothion-Synthese 75
3.4.2 Die identifizierten Methyltransferasen 75
3.4.3 Die Identifikation der TPMT 76
3.5 Nachweis der Thiopterin-Methylierung durch die TPMT 76
3.6 Der Abbau Moco-abhängiger Proteine und ihres Cofaktors 79
3.6.1 Die Degradation Moco-abhängiger Proteine 79
3.6.2 Der postulierte Moco-Abbau zu Urothion 80
3.6.2.1 Die potentiell unkatalysierten Reaktionen im Moco-Abbau 81
3.6.2.2 Die potentiell enzymkatalysierten Reaktionen im Moco-Abbau 84
3.7 Die in vivo Funktion der TPMT 86
3.7.1 Inhibitionsexperimente der TPMT 86
3.7.2 In vitro Urothion-Synthese in Leber-Rohextrakt von TPMT7 - und Wf-Mäusen 87
3.7.3 TPMT-Phänotypisierung über die Urothion-Synthese in humanen Organ-Zytosoien87
3.7.4 TPMT-Phänotypisierung über den Urothion-Gehalt im Urin 92
3.8 Die vorgenommene Urothion-Urindiagnostik 93
3.9 Mögliche Einflussfaktoren auf die Urothion-Ausscheidung im Urin 95
3.10 Zukünftige Studien und die Veränderung der Urothion-Urindiagnostik 96
3.11 Möglichkeiten mit Urothion als Biomarker für die TPMT-Defizienz 97
3.12 Die Bedeutung der TPMT-Defizienz für den Moco-Abbau 98
4 MATERIALIEN 101
4.1 Enzyme, Chemikalien und Antikörper 101
4.2 Organismen und Stämme 101
4.3 Plasmide 102
4.4 Protein-Konstrukte 103
4.5 Primer 103
4.6 Molekulargewichts- und Längenstandards 103
5 METHODEN 104
5.1 Molekularbiologische Methoden 104
5.1.1 Kultivierung und Lagerung von E.coli 104
5.1.2 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen 104
5.1.3 Hitzeschock-Transformation 104
5.1.4 Konzentrationsbestimmung von DNA 105
5.1.5 Klonierung 105
5.1.6 Plasmidamplifikation 106
5.1.7 Polymerase-Kettenreaktion 106
5.2 Biochemische Methoden 107
5.2.1 Expression und Reinigung rekombinanter Proteine aus E. coli 107
5.2.2 Zellaufschluss und Probenvorbereitung 108
5.2.3 Affinitätschromatographie 108
5.2.3.1 Ni-NTA-Matrix 108
5.2.3.2 Chitin-Matrix 109
5.2.4 Konzentrierung und Umpufferung aufgereinigter Proteine 109
5.2.5 Konzentrationsbestimmung aufgereinigter Proteine 110
5.2.6 Proteinkonzentrationsbestimmung in Organ-Rohextrakten 110
5.2.7 Herstellung von Organ-Rohextrakten aus M. musculus 111
5.2.8 Herstellung von humanem Leberzytosol 111
5.2.9 Herstellung von humanem Erythrozyten-Lysat 111
5.2.10 In vitro MPT-Synthese 112
5.2.11 In vitro Urothion-Synthese 112
5.2.11.1 In vitro Urothion-Synthese in Organ-Rohextrakten 113
5.2.11.2 TPMT-abhängige in vitro Urothion-Synthese 113
5.2.12 Alkalische Phosphatase-Behandlung 114
5.2.13 Michaelis-Menten TPMT-Kinetik: 114
5.3 Analytische Methoden 115
5.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 115
5.3.2 Immunoblotting 115
5.3.3 Analytische HPLC-Analyse 116
5.3.3.1 HPLC-Analyse von 6-Methylmercaptopurin (6-MMP) 117
5.3.3.2 HPLC-Analyse von in vitro synthetisiertem Urothion und Jukathion 117
5.3.3.3 HPLC-Analyse von Urothion aufgereinigt aus Urinproben 117
5.3.4 HPLC-Form A-Analyse zur Konzentrationsbestimmung von Moco und MPT 118
5.3.5 Massenspektometrie 118
5.4 Chromatographische Aufreinigung von Urothion 119
5.4.1 Urothion-Aufreinigung aus Urin 119
5.4.1.1 Chromatographische Reinigung über Florisil-Matrix 120
5.4.1.2 Chromatographische Reinigung über Aminopropyl-Matrix 120
5.4.1.3 Reinigung über präparative Umkehrphasen C1 B-Chromatographie 121
5.4.2 Quantifizierung von Urothion in Urinproben 122
5.4.2.1 Quantitative Aufreinigung von Urothion aus Urin 122
5.4.2.2 Kreatininbestimmung nach Jaffé 122
5.4.3 QAE-Sepharose Aufreinigung von Urothion 123
5.5 Verifizierung der Identität von Urothion 123
5.5.1 Analytische Dünnschichtchromatographie 123
5.5.2 pH-abhängige UV-Vis-Spektrometrie 124
5.6 Anreicherung und Identifikation der Urothfon-Syntheseaktivität 124
5.6.1 Ammoniumsulfatpräzipitation 125
5.6.2 Anionenaustauschchromatographie 126
5.6.3 Größenausschlusschromatographie 126
5.6.4 NanoLC-ESI-MS/MS und Datenanalyse 127
6 ANHANG 128
6.1 Weitere Daten zur Urothion-Syntheseaktivität-Anreicherung 128
6.2 Rohdaten der in vitro Urothion-Synthese zur Bestimmung des TPMT-Genotyps 131
7 LITERATURVERZEICHNIS 133
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