Funktionelle Rekonstitution und Charakterisierung eines fluoreszenzmarkierten c-Met-Rezeptorkomplexes:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2003
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
HGF
UND
SEIN
REZEPTOR
C-MET
STRUKTUR
UND
BIOLOGISCHE
FUNKTIONEN
.
1
1.2
DIE
ROLLE
VON
C-MET
IN
DER
TUMORIGENESE
.
3
1.3
SIGNALTRANSDUKTION
AM
C-MET-REZEPTOR
UND
KORRELATION
MIT
PHYSIOLOGISCHEN
UND
PATHOLOGISCHEN
PROZESSEN
.
7
1.4
GABI
ALS
HAUPTPHOSPHORYLIERUNGSSUBSTRAT
VON
C-MET
.
9
1.5
NEUE
EXPERIMENTELLE
ZUGAENGE
ZUR
AUFKLAERUNG
VON
VORGAENGEN
IN
DER
C-MET-
VERMITTELTEN
SIGNALTRANSDUKTION
UND
THEORETISCHE
VORUEBERLEGUNGEN
.
10
1.6
ZIELE
DER
ARBEIT
.
13
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
14
2.1
ARBEITEN
MIT
DNA
UND
RNA
.
14
2.1.1
ESCHERICHIA
COLI-STAEMME
.
14
2.1.2
HERSTELLEN
KOMPETENTER
E.
COLI
.
14
2.1.2.1
JM109
.
14
2.1.2.2
TOPLO
.
14
2.1.2.3
XLLBLUE
.
15
2.1.3
KULTIVATION
VON
E.
COLI
.
15
2.1.4
TRANSFORMATION
VON
ELEKTRISCH
KOMPETENTEN
JM109
.
15
2.1.5
TRANSFORMATION
VON
CHEMISCH
KOMPETENTEN
JM109
UND
TOPLO
.
15
2.1.6
TRANSFORMATION
VON
CHEMISCH
KOMPETENTEN
XLLBLUE
.
16
2.1.7
DNA-PRAEPARATION
AUS
E.COLI
.
,
.
16
2.1.7.1
MINI-PRAEPARATION
VON
DNA
.
16
2.1.7.2
MIDI-PRAEPARATION
VON
DNA
.
16
2.1.8
VERWENDETE
PLASMIDE
.
17
2.1.9
OLIGONUKLEOTIDE
.
17
2.1.10
ENZYMATISCHE
ARBEITEN
MIT
DNA
.
18
2.1.10.1
VERWENDETE
ENZYME
.
18
2.1.10.2
VERDAU
DURCH
RESTRIKTIONS-ENDONUKLEASEN
.
18
2.1.10.2.1
ANALYTISCH
.
18
2.1.10.2.2
PRAEPARATIV
.
18
2.1.10.3
LIGATION
VON
DNA-ENDEN
.
18
2.1.10.4
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(=
PCR)
.
19
2.1.11
PHENOLISIEREN
UND
FAELLEN
VON
DNA
.
19
2.1.12
ISOLIERUNG
VON
MRNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
20
2.1.13
RT-PCR
.
20
2.1.14
PROTEASE-CDNA-ARRAYS
.
20
2.1.15
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
.
20
2.1.16
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
21
2.1.17
DNA-SEQUENZANALYSE
.
21
2.1.18
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
&
RNA
.
21
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.1.19
DNA
GROESSENSTANDARDS
.
21
2.2
ARBEITEN
IN
DER
ZELLKULTUR
.
22
2.2.1
ZELLINIEN
.22
2.2.2
KULTIVATIONSBEDINGUNGEN
.22
2.2.3
KRYOKONSERVIERUNG
UND
INKULTUMAHME
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN.
22
2.2.4
TRANSFEKTION
MIT
LIPOFECTAMINE
.
22
2.2.5
NIH5.15
.
23
2.2.6
STABILE
TRANSFEKTION
.
23
2.2.7
TRANSFEKTION
VON
NIH5.15
MIT
PCDNA3.1-ZEO+-TRK/MET-BFP
.
23
2.2.8
GEWINNUNG
VON
ZELLPELLETS
.
23
2.2.9
YYSOFT-AGAR-ASSAY"
.
24
2.2.10
STIMULATION
VON
ZELLEN
.
24
2.2.11
INDUKTION
DES
DOXYZYKLIN-REGULIERBAREN
PROMOTORS
.
25
2.2.12
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
25
2.2.13
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
.
26
2.2.13.1
KONVENTIONELL
.
26
2.2.13.2
ZWEI-PHOTONEN-TECHNIK
.
27
2.2.14
MATRIGEL-DURCHWANDERUNGSASSAYS
IN
EINER
BOYDEN
CHAMBER
.
28
2.3
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
.
29
2.3.1
VERWENDETE
ANTIKOERPER
.
29
2.3.2
ZELLYSE
.
30
2.3.3
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.30
2.3.4
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
30
2.3.5
HERSTELLUNG
VON
GESAMTZELLYSATEN
.
31
2.3.6
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
31
2.3.7
WESTERN
BLOT
.
32
2.3.8
ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY=
EMSA
.
33
2.4
LOESUNGEN,
MATERIALIEN
UND
PUFFER
.
33
2.5
SONSTIGE
HILFSMITTEL
.
35
3
ERGEBNISSE
.
36
3.1
KONSTRUKTION
DES
TRK/MET-BFP
FUSIONSPROTEINS
.
36
3.1.1
UMKLONIERUNG
DER
TRK/MET-CDNA
AUS
DEM
VEKTOR
PBAT-TM
.
38
3.1.2
AMPLIFIKATION
DES
3'-TERMINUS
DER
TRK/MET-CDNA:
MET-PCR
.
39
3.1.3
AMPLIFIKATION
DES
GENS
FUER
BFP
AUS
DEM
VEKTOR
PQBI50:
BFP-PCR
.40
3.1.4
YYPCR
BY
OVERLAP
EXTENSION"
PCRVII
ZUR
GENERIERUNG
EINES
NEUEN
3
-
ENDES
FUER
TRK/MET
.
40
3.1.5
VORBEREITEN
VON
PCDNA3.0
FUER
DIE
EINKLONIERUNG
VON
TRK/MET
.
41
3.1.6
EINKLONIEREN
DER
TRK/MET-DNA
IN
DIE
PCDNA
3.0
-
GENERIERUNG
VON
PCDNA3.0-TRK/MET
.42
3.1.7
KLONIERUNG
DER
PCRVII
IN
DIE
PCDNA3.0-TRK/MET
-
UND
ERSTELLEN
DER
PCDNA3.0-TRK/MET-BFP
ALS
FINALES
KONSTRUKT
.
43
3.2
EXPRESSIONSNACHWEIS
DES
TRK/MET-BFP
UND
DES
GABL-D2EGFP-KONSTRUKTS
IN
MURINEN
FIBROBLASTEN
.
45
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.2.1
IM
WESTERN
BLOT
.
45
3.2.2
IN
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHEN
UNTERSUCHUNGEN
.
47
3.3
FUNKTIONALITAETSNACHWEIS
IN
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONEN
.49
3.3.1
NACHWEIS
DER
SIGNALTRANSDUKTION
ZWISCHEN
DEM
TRK/MET-BFP-REZEPTOR
UND
DEM
GABL-D2EGFP
MITTELS
WESTERN
BLOT
.49
3.3.2
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
DARSTELLUNG
VON
KOMPONENTEN
DER
C-MET
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE
.
51
3.3.2.1
DETEKTION
DES
TRK/MET-BFP-REZEPTORS
DURCH
EM
GEFRIERBRUCHTECHNIK
.
51
3.3.2.2
DETEKTION
VON
GABI
IN
TRANSIENT
MIT
TRK/MET-BFP
UND
GABL
D2EGFP
TRANSIFIZIERTEN
ZELLEN
.
52
3.3.3
VERSUCH
DER
DARSTELLUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
UMVERTEILUNG
DES
GABI
AN
DIE
ZELLMEMBRAN
MITTELS
FRET
.
55
3.3.4
AKTIVIERUNG
NACHGESCHALTETER
MOLEKUELE
IM
C-MET-SIGNALWEG
ANHAND
VON
ERK
.56
3.3.5
AKTIVIERUNG
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
DURCH
DAS
HETEROLOGE
TRK/MET
BFP-KONSTRUKT
.57
3.3.6
UNTERSUCHUNGEN
HINSICHTLICH
STAT-AKTIVITAET
IM
WESTERN
BLOT
.
59
3.3.6.1
STATI
.59
3.3.OE.2
STAT3
.
60
3.4
ERZEUGUNG
UND
FUNKTIONELLE
UNTERSUCHUNG
VON
STABILEN
ZELLINIEN,
DIE
FLUORESZENZ-FUSIONEN
VON
TRK/MET
UND
GABI
EXPRIMIEREN
.
61
3.4.1
HERSTELLUNG
STABILER
TRANSFEKTANTEN
.
61
3.4.2
TRANSFEKTION
MIT
PCDNA3.1ZEO-TRK/MET-BFP
.63
3.4.3
VORVERSUCH
ZUR
ERMITTLUNG
DER
INDUZIERBARKEIT
STABILER
KLONE
.
63
3.4.4
EXPRESSIONSNACHWEIS
IN
STABILEN
TRANSFEKTANTEN
.
65
3.4.4.1
NACHWEIS
DES
TRK/MET-REZEPTORS
AUF
MRNA-EBENE
.
65
3.4.4.2
NACHWEIS
DER
TRANSFIZIERTEN
PROTEINE
MITTELS
IMMUNPRAEZIPITATION67
3.4.5
MATRIXUNABHAENGIGES
WACHSTUM
STABIL
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
IN
SOFT-AGAR68
3.4.6
ERFASSUNG
DES
PROTEASE-EXPRESSIONMUSTERS
STABILER
ZELLEN
MIT
CDNA
ARRAYS
.
71
3.4.7
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
STATI
MIT
DEM
TRK/MET-REZEPTOR
.
73
3.4.8
WESTERN
BLOT
MIT
STABILEN
ZELLEN
ZUR
KLAERUNG
DES
EINFLUSSES
DER
GABI
EXPRESSION
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
STAT3
.
74
3.4.9
MATRIGEL-ASSAYS
.
74
4
DISKUSSION
.77
EXPRESSIONS
UND
FUNKTIONALITAETSNACHWEIS
DES
TRK/MET-BFP
UND
DES
GABL
D2EGFP-KONSTRUKTS
IN
MURINEN
FIBROBLASTEN
.77
ZELLULAERE
LOKALISATION
UND
VERTEILUNG
VON
KOMPONENTEN
DER
C-MET-
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE
.77
GENERIERUNG
STABIL
TRK/MET-BFP
UND
GABL-D2EGFP
EXPRIMIERENDER
ZELLEN
.83
AKTIVIERUNG
DER
NACHGESCHALTETEN
EFFEKTOREN
ERK
UND
STAT1/3
DURCH
DEN
MET
REZEPTOR
.84
INHALTSVERZEICHNIS
IV
MATRIXUNABHAENGIGES
WACHSTUM
STABIL
TRK/MET-BFP
UND
GABL-D2EGFP
EXPRIMIERENDER
ZELLEN
IN
SOFT-AGAR
.
89
PROTEASE-EXPRESSIONSMUSTER
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
C-MET/GABL-FUNKTION
.92
MIGRATIONSVERHALTEN
BEI
UNTERSCHIEDLICHEN
AKTIVIERUNGSZUSTAENDEN
DES
C
MET/GABL-SYSTEMS
.
93
AUSBLICK
.
95
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
97
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
99
7
ANHANG
.
122
7.1
ABKUERZUNGEN
UND
FORMELZEICHEN
.
122
7.2
VEKTORKARTEN
UND
NUKLEOTIDSEQUENZEN
.
124
7.2.1
PBAT-TM
.
125
7.2.2
PQBI50
.
125
7.2.3
PBI4-GABL-D2EGFP
.
125
7.2.4
PD2EGFP-NL
.
126
7.2.5
PCDNA3.0-TRK/MET-BFP
.
127
7.3
DNA-GROESSENSTANDARDS
.
131
7.4
AUFTRAGSSCHEMA
DES
CDNA-ARRAYS
.
131
7.5
DANKSAGUNG
.
132
7.6
LEBENSLAUF
.
133
7.7
EHRENWOERTLICHE
ERKLAERUNG
.
134 |
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