Mechanismus und genetische Basis der Cytopathogenität einer Hepatitis A-Virusvariante in Zellkultur:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Bremen, Univ., Diss., 1999 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
HEPATITIS
A-VIRUS
1
1.2
ZELLULAERE
ANTIVIRALE
ABWEHRMECHANISMEN
9
1.21
APOPTOSE
9
1.22
INTERFERON
SYSTEM
14
1.3
ZIELSETZUNG
19
2
MATERIAL
UND
METHODEN
20
21
MATERIAL
20
21.1
VIREN
20
21.1.1
HEPATITIS
A-VIRUS
20
21.1.2
VESICULAR-STOMATITIS-VIRUS
20
21.2
ZELLEN
20
21.3
BAKTERIEN
22
21.4
ZELLKULTURMEDIEN
UND
-ZUSAETZE
22
21.5
PLASMIDE
22
21.5.1
PHAV/7
22
21.5.2
PSP64
UND
PSP65
23
21.5.3
PGL2-CONTROL
23
2.1.6
SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE
23
21.6.1
PCR-PRIMER
23
21.6.1.1
HAV-SPEZIFISCHE
PRIMER
23
21.6.1.2
INTERFERON-SS-SPEZIFISCHE
PRIMER
25
21.6.1.3
SS-ACTIN-SPEZIFISCHE
PRIMER
25
21.6.2
PRIMER
FUER
SEQUENZANALYSEN
25
21.6.3
DIVERSE
25
21.7
PROTEINE
25
21.7.1
ENZYME
25
21.7.2
ANTIKOERPER
26
21.7.3
DIVERSE
26
2.1.8
ANTIBIOTIKA
26
21.9
CHEMIKALIEN
26
21.10
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
28
21.11
STANDARDS
28
21.12
PUFFER
UND
LOESUNGEN
28
21.121
ZELLZAHL-
UND
ZELLVITALITAETSBESTIININUNG
28
21.122
ZELLVITALITAETSTEST
28
2.1.12.3
DARSTELLUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
APOPTOTISCHEN
ZELLEN
28
21.124
QUANTITATIVER
APOPTOSENACHWEIS
MIT
DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
28
21.125
TUNEL-REAKTION
28
21.126
NACHWEIS
VON
PHOSPHATIDYLSERIN
29
21.12.7
NACHWEIS
VON
REAKTIVEN
SAUERSTOFFINTETMEDIATEN
29
21.128
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
29
2.1.12.9
ANTIOXIDANTIEN
29
21.1210
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
29
2.1.1211
RADIOIMMUNOFOCUS-ASSAY
UND
PLAQUETEST
29
2.1.1212
PLAQUEREDUKTIONSTEST
30
21.12.13
ISOLIERUNG
ZELLULAERER
RNA
30
21.12.13.1
HYPOTONE
LYSE
MIT
NP-40
30
2.1.1213.2
SAUTE
GUANIDIN-/PHENOL-EXTRAKTION
30
21.12.14
PHENOL-/CHLOROFORM-EXTRAKTION
UND
ETHANOL-PRAEZIPITATION
VON
NUKLEINSAEUREN
30
21.1215
DNA-DEGRADATION
MIT
DNASE
I
31
21.12.16
ANTIGEN-CAPTURE-RT-PCR
31
21.1217
REVERSE
TRANSKRIPTION
31
21.1218
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
31
21.1219
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
31
21.12.20
LIGATION
VON
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
MIT
DER
T4-DNA-LIGASE
32
21.12.21
BAKTERIENKULTUREN
32
21.1222
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
32
2.1.1223
SCHNELLPRAEPARATION
VON
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
32
21.12.24
PRAEPARATION
VON
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
33
21.1225
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
33
21.1225.1
ALKALISCHE
DENATURIERUNG
33
21.1225.2
DNA-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
33
21.1226
IN
ZRO-TRANSKRIPTION
34
21.1227
TRANSFEKTION
MIT
DER
DEAE-DEXTRAN-METHODE
34
21.12.28
DIVERSE
34
21.13
KITS
34
2.1.14
VERBRAUCHSMATERIALIEN
35
21.15
GERAETE
UND
ANDERE
HILFSMITTEL
35
22
METHODEN
36
221
ZELLKULTIVIERUNG
36
2.2.2
KRYOKONSERVIERUNG
VON
ZELLEN
36
22.3
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
36
224
MYKOPLASMEN-NACHWEIS
37
225
ZELLVITALITAETSTEST
37
22.6
APOPTOSENACHWEISE
38
226.1
DARSTELLUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
APOPTOTISCHEN
ZELLEN
38
226.2
TUNEL-REAKTION
38
226.3
ZELLKEMFARBUNG
MIT
PROPIDIUMJODID
39
2.26.4
QUANTITATIVER
APOPTOSENACHWEIS
MIT
DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
39
2.26.5
NACHWEIS
VON
PHOSPHATIDYLSERIN
39
226.6
NACHWEIS
VON
REAKTIVEN
SAUERSTOFFINTERMEDIATEN
40
2.26.7
FIXIERUNG
VON
ZELLEN
FUER
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
40
227
INFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
HAV
41
2.28
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
ZUM
NACHWEIS
VON
HAV-ANTIGEN
41
228.1
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
AUSWERTUNG
41
228.2
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
AUSWERTUNG
42
229
HERSTELLUNG
VON
HEPATITIS
A-VIRUSPOOLS
42
2210
VIRUSTITRATION
43
2210.1
BESTIMMUNG
DER
TAD
M
43
2210.2
RADIOIMMUNOFOCUS-ASSAY
43
2210.3
PLAQUETEST
44
2211
INTERFERONNACHWEIS
MIT
DEM
PLAQUEREDUKTIONSTEST
44
2212
RT-PCR
45
22121
ANTIGEN-CAPTURE-RT-PCR
45
2212.2
NACHWEIS
VON
HAV-RNA
46
2212.3
NACHWEIS
VON
INTERFERON-SS-MRNA
47
2212.4
NACHWEIS
VON
SS-ACTIN-MRNA
47
22.13
GEWINNUNG
UND
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
48
2.2.13.1
ISOLIERUNG
VON
ZELLULAERER
RNA
48
2.2.13.1.1
HYPOTONE
LYSE
MIT
NP-40
48
2.2.13.1.2
SAURE
GUANIDIN-/PHENOL-EXTRAKTION
48
ZZ13.2
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
UND
ETHANOL-PRAEZIPITATION
VON
NUKLEINSAEUREN
49
Z2.13.3
DNA-REINIGUNG
DURCH
GELELEKTROPHORESE
MIT
NIEDRIG
SCHMELZENDER
AGAROSE
49
2.2.14
PHYSIKALISCHE
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
50
2.2.14.1
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONS-,
STOFFMENGEN
UND
REINHEITS
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
50
2.2.14.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
50
Z2.15
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
NUKLEINSAEUREN
50
ZZ15.1
DNA-DEGRADATION
MIT
DNASE
I
50
ZZ15.2
AUFFUELLREAKTION
VON
PCR-PRODUKTEN
MIT
DEM
KLENOW-FRAGMENT
DER
DNA-POLYMERASE
I
VON
E.
COLI
51
Z2.15.3
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
51
Z2.15.3.1
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
51
2.2.15.3.2
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG
VON
PSP64
UND
PSP65
51
2.2.15.3.3
LINEARISIERUNG
DES
VEKTORS
PHAV/7
52
Z2.15.4
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
52
2.2.15.5
LIGATION
VON
DNA-MOLEKUELEN
MIT
DER
T4-DNA-LIGASE
53
Z2.16
VERMEHRUNG
UND
GEWINNUNG
VON
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
53
Z2.16.1
PRAEPARATION
KOMPETENTER
E.
COLI
53
Z2.16.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COH
54
ZZ16.3
SCHNELLPRAEPARATION
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
54
2.2.16.4
PRAEPARATION
VON
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
54
Z2.17
DNA-SEQUENZIERUNG
55
ZZ17.1
ALKALISCHE
DENATURIERUNG
VON
DNA
55
ZZ17.2
SEQUENZIERUNG
MIT
DEM
^SEQUENCING
KITYY
56
ZZ17.3
DNA-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
56
ZZ18
IN
RIZRO-TRANSKRIPTION
VON
HAV-CDNA
57
2.Z19
TRANSFEKTION
MIT
DER
DEAE-DEXTRAN-METHODE
57
Z2.19.1
TRANSFEKTION
VON
HAV/7-RNA
57
2.2.19.2
TRANSFEKTION
VON
POLY(I)POLY(C)
UND
PGL2-CONTROL
57
2.Z20
NACHWEIS
DER
LUCIFERASE-AKTIVITAET
ALS
INDIKATOR
FUER
DIE
PROTEIN
SYNTHESERATE
58
3.
ERGEBNISSE
59
3.1
KLONALE
SELEKTION
DER
CYTOPATHOGENEN
HAV-VARIANTE
HAV^
HB
,
(
59
3.2
VIRUSPOOLS
VON
HAV
CJT
HBI
,
UND
HAV/7
62
3.2.1
HAV
CYT/HB1
|
62
3.2.2
HAV/7
63
3.3
BEEINFLUSSUNG
DER
ZELLVITALITAET
DURCH
HAV
CYT
HB11
UND
HAV/7
64
3.4
SENSITIVITAET
DER
CYTOPATHOGENITAET
VON
HAV
EYT/HB1
,
GEGENUEBER
CHLOROFORM
64
3.5
PARTIELLE
VERGLEICHENDE
CDNA-SEQUENZANALYSE
VON
HAV^.^,
,
65
3.6
REPLIKATIONSKINETIK
VON
HAV
CYT/HB11
UND
HAV/7
IN
FRHK-4-ZELLEN
70
3.7
REPLIKATION
VON
HAV
CYT;HB
,
,
IN
ANDEREN
ZELLEN
72
3.8
APOPTOSEINDUKTION
DURCH
H
AV
RVT;HB1
,
72
3.8.1
DARSTELLUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
HAV-INFIZIERTEN
FRHK-4-ZELLEN
73
3.8.2
MORPHOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
HAV-INFIZIERTER
FRHK-4-ZELLEN
75
3.8.21
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
75
3.8.22
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
76
3.8.3
NACHWEIS
VON
PHOSPHATIDYLSERIN
UND
REAKTIVEN
SAUERSTOFFINTERMEDIATEN
77
3.8.4
QUANTITATIVER
HAV
UND
APOPTOSENACHWEIS
MIT
DER
DURCHFLUSSZYTOME
TRIE
80
3.9
BEEINFLUSSUNG
DER
HAV-INDUZIERTEN
APOPTOSE
DURCH
ANTIOXIDANTIEN
81
3.9.1
APOPTOSEINDUKTION
IN
FRHK-4-ZELLEN
DURCH
H
2
O
2
82
3.9.2
HEMMUNG
DER
HAV
CJT/HBI
,
-INDUZIERTEN
DNA-FRAGMENTATION
DURCH
ANTIOXIDANTIEN
83
3.9.3
BEEINFLUSSUNG
DER
VITALITAET
HAV^^U-INFIZIERTER
FRHK-4-ZELLEN
DURCH
ANTIOXIDANTIEN
84
3.10
HEMMUNG
DER
HAV^^,
,-INDUZIERTEN
APOPTOSE
DURCH
REDUKTION
DER
VIRUSPRODUKTION
86
3.10.1
REPLIKATIONSKINETIK
UND
APOPTOSEINDUKTION
VON
HAV^^,
T
BEI
30
C
86
3.10.2
REPLIKATION
VON
HAV
CYT/HB1
J
UND
APOPTOSEINDUKTION
IN
PERSISTENT
HAV/7-INFIZIERTEN
FRHK-4
ZELLEN
88
3.11
BETEILIGUNG
DES
INTERFERONSYSTEMS
AN
DER
DURCH
HAV^
HB
,
,
INDUZIERTEN
APOPTOSE
90
3.11.1
POLY(I)-POLY(C)-INDUZIERTE
EFFEKTE
BEI
FRHK-4-ZELLEN
91
3.11.1.1
INDUKTION
VON
APOPTOSE,
INTERFERON
UND
RNASE
L-AKTIVITAET
91
3.11.1.2
KINETIK
DER
INTERFERONPRODUKTION,
RNASE
L-AKTIVIERUNG
UND
APOPTOSE
NACH
INDUKTION
DURCH
POLY(I)POLY(C)
93
3.11.2
NACHWEIS
VON
INTERFERON-SS-MRNA
IN
HAV-INFIZIERTEN
FRHK-4-ZELLEN
95
3.11.3
RNASE
L-AKTIVIERUNG
IN
HAV-INFIZIERTEN
FRHK-4-ZELLEN
96
3.11.4
HEMMUNG
DER
HAV^/NGU-INDUZIERTEN
APOPTOSE
DURCH
DEN
PKR
98
INHIBITOR
2-AMINOPURIN
3.12
BEEINFLUSSUNG
DER
PROTEINSYNTHESE
DURCH
HAV
101
3.12.1
APOPTOSEINDUKTION
IN
FRHK-4-ZELLEN
DURCH
HEMMUNG
DER
101
PROTEINSYNTHESE
3.12.2
PROTEINSYNTHESE
IN
HAV-INFIZIERTEN
FRHK.-4-ZELLEN
102
3.13
ANTIAPOPTOTISCHE
EIGENSCHAFTEN
DES
HAV
103
4.
DISKUSSION
110
5.
ZUSAMMENFASSUNG
139
6.
LITERATURVERZEICHNIS
141 |
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