Untersuchungen zum Vorkommen von Mutationen in den Nichtstrukturproteingenen 3c und 7b des felinen Coronavirus bei spontanen FIP-Fällen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2013
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition scientifique
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG L
2 LITERATURUEBERSICHT 3
2.1 FELINE INFEKTIOESE PERITONITIS 3
2.1.1 GESCHICHTE UND EPIZOOTIOLOGIE 3
2.1.2 AETIOLOGIE 5
2.1.2.1 CORONAVIREN 5
2.1.2.1.1 MORPHOLOGIE 5
2.1.2.1.2 GENOM 7
2.1.2.1.3 REPLIKATIONSZYKLUS 8
2.1.2.1.4 CORONAVIREN UND MUTATIONEN 9
2.1.2.1.5 EINTEILUNG DER CORONAVIREN 10
2.1.2.1.6 FELINE CORONAVIREN 12
2.1.3 KLINISCHES BILD UND DIAGNOSE 15
2.1.4 PATHOGENESE 17
2.1.5 PROPHYLAXE UND THERAPIE 21
2.2 NICHTSTRUKTURPROTEINGENE 23
2.2.1 NICHTSTRUKTURPROTEINGENE BEI FELINEN CORONAVIREN 23
2.3 FCOV-STAEMME - UNTERSCHIEDE UND GEMEINSAMKEITEN 27
3 MATERIAL UND METHODEN 29
3.1 UNTERSUCHUNGSMATERIAL 29
3.2 PRAEPARATION DER GEWEBE FUER DIE HISTOPATHOLOGISCHE UND
IMMUNHISTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG 30
3.2.1 HISTOPATHOLOGISCHE DIAGNOSE 30
3.2.2 IMMUNHISTOLOGISCHE DIAGNOSE 31
3.3 PRAEPARATION DER GEWEBE FUER DIE MOLEKULARBIOLOGISCHE AUFARBEITUNG 33
3.4 ISOLIERUNG VON RNA AUS GEWEBE 33
3.4.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS UNFIXIERTEM GEWEBE MITTELS QIAGEN
RNEASY MINI KIT UND QIAGEN QIASHREDDER TUBES 33
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.2 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS UNFIXIERTEM GEWEBE MITTELS QIAGEN
RNEASY MINI KIT UND NEXT ADVANCE BULLET BLENDER BLUE 50
(HOMOGENISATOR) 36
3.4.3 ISOLIERUNG VON VIRUS-RNA AUS KOTPROBEN MITTELS QIAGEN QIAAMP
VIRAL
RNA MINI KIT... 37
3.5 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER ISOLIERTEN RNA 39
3.6 REVERSE TRANSKRIPTION 39
3.7 AMPLIFIKATION DES GENOMABSCHNITTS ORF 3C 42
3.7.1 SEMI-NESTED PCR 45
3.8 AMPLIFIKATION EINER SEQUENZ AUS DEM GAPDH-GEN DER KATZE ZUR
KONTROLLE
DER RNA-ISOLIERUNG SOWIE DER REVERSEN TRANSKRIPTION 47
3.9 AMPLIFIKATION DES GENOMABSCHNITTS ORF 7B 48
3.10 ERGEBNISKONTROLLE MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE 50
3.11 DNA-SEQUENZIERUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE 51
3.12 STATISTISCHE ANALYSE 53
4 ERGEBNISSE 54
4.1 UNTERSUCHUNG DER REFERENZSEQUENZEN 54
4.2 UEBERPRUEFUNG DER PRIMER 59
4.2.1 KOMBINATION VERSCHIEDENER PRIMER 64
4.3 UNTERSUCHUNG DER KATZENGEWEBE AUF FELINE CORONAVIREN 65
4.3.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER GESAMT-RNA 65
4.3.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION 66
4.3.2.1 GLYCERINALDEHYD-3-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE-GEN 66
4.3.2.2 NICHTSTRUKTURPROTEINGEN ORF 3C 67
4.3.2.2.1 ERSTE PCR 67
4.3.2.2.2 SEMI-NESTED PCR (ZWEITE UND DRITTE PCR) 71
4.3.2.3 NICHTSTRUKTURPROTEINGEN ORF 7B 74
4.4 KOTPROBEN 78
4.5 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN IMMUNHISTOLOGISCHEM SIGNAL, NACHWEIS VON
ORF 3C/7B UND FIP-FORM 79
4.6 HAEUFIGKEIT DES NACHWEISES VON ORF 3C/7B IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN 80
4.7 SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE 80
4.7.1 SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE VON ORF 3C 80
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.7.1.1 MUTATIONSANALYSE 88
4.7.2 SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE VON ORF 7B 91
4.8 AMINOSAEURESEQUENZEN 95
4.8.1 AMINOSAEURESEQUENZEN VON ORF 3C 95
4.8.1.1 HAEUFIGKEIT DES AUFTRETENS VON STOPCODONS BEI FECV UND FIPV 98
4.8.2 AMINOSAEURESEQUENZEN VON ORF 7B 100
4.9 GESCHLECHTERVERTEILUNG DER KATZEN MIT DELETIONEN UND/ODER STOPCODONS
IN ORF 3C 102
4.10 MUTATIONEN UND PATHOLOGISCH-ANATOMISCHE VERAENDERUNGEN 102
5 DISKUSSION 103
5.1 UNTERSUCHUNG VON FCOV DER NCBI-GENBANK 103
5.2 QUALITAET DER ISOLIERTEN RNA 104
5.3 EFFIZIENZ VERSCHIEDENER RNA-ISOLIERUNGSMETHODEN 105
5.4 PROBLEMATIK BEI DER PRIMERWAHL 105
5.5 AUSSAGEKRAFT DER AGAROSEGELELEKTROPHORESE 106
5.6 AUSWERTUNG UND AUSSAGEKRAFT DER SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE 107
5.7 NACHWEISBARKEIT VON ORF 3C 107
5.7.1 SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE VON ORF 3C 108
5.7.1.1 MUTATIONEN 110
5.8 NACHWEISBARKEIT VON ORF 7B 112
5.8.1 SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE VON ORF 7B 112
5.8.1.1 MUTATIONEN 112
5.9 ANALYSE DER AMINOSAEURESEQUENZEN 113
5.9.1 AMINOSAEURESEQUENZEN VON ORF 3C 114
5.9.2 AMINOSAEURESEQUENZEN VON ORF 7B 115
5.10 VERGLEICH DER NACHWEISBARKEIT VON ORF 3C UND ORF 7B 115
5.11 ASSOZIATION VON GESCHLECHT, PATHOLOGISCH-ANATOMISCHEM
ERSCHEINUNGSBILD UND IMMUNHISTOLOGISCHEM SIGNAL MIT DEM
NICHTSTRUKTURPROTEINGEN 3C 118
5.12 NICHTSTRUKTURPROTEINGENE UND IMMUNOLOGISCHE VORGAENGE 119
5.13 BEDEUTUNG DER ERGEBNISSE FUER DIE DIAGNOSTIK UND DIE VORSTELLUNGEN
VON DER PATHOGENESE DER FIP 120
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
6 ZUSAMMENFASSUNG 122
7 SUMMARY 124
8 LITERATURVERZEICHNIS 126
9 ANHANG 137
9.1 TABELLEN 137
9.2 GENETISCHER CODE 164
9.3 BEZUGSQUELLEN FUER CHEMIKALIEN, KITS UND ANTIKOERPER 166
9.4 BEZUGSQUELLEN FUER GERAETE UND GEBRAUCHSMATERIALIEN 168
9.5 LOESUNGEN UND PUFFER 170
10 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 173
11 DANKSAGUNG 176
IV
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