Interaktion zwischen TGF-[beta]-Smad-3 und dem Glukokortikoidrezeptor vermittelten Signalweg in hepatischen Sternzellen:
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2005
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Pathogenese der Leberfibrose 1
1.2. Die TGF-ß-Signaltransduktion 3
1.3. Struktur und Funktion des Glukokortikoidrezeptors 5
1.4. Interaktion zwischen TGF-ß und GR-Signalwegen 8
1.5. Zielsetzung der Arbeit 10
2. Material und Methoden 11
2.1. Material 11
2.1.1. Chemikalien und Enzyme 11
2.1.2. Lösungen undPufler 12
2.1.3. Gele 12
2.1.4. Agarplatten, Zellkultur- und Bakterienmedien 12
2.2. Melhoden 13
2.2.1. Präparation von Hepatischen Stemzellen (HSC) aus der Rattenleber 13
2.2.2. Zellkultur von primären Zellen (HSC, MTB) und Zelllinien (CFSC, HEK293) 13
2.2.3. Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellkultur 14
2.2.4. DNA-Amplifikation (PCR) 14
2.2.5. DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung 16
2.2.6. Automatische Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA und Plasmid-DNA 16
2.2.7. mRNA Quantifizierung 18
2.2.7.1. In vitro Transkription 18
2.2.7.2. Reverse Transkription 18
2.2.8. Herstellung rekombinanter Glukokortikoidrezeptor-Adenoviren 20
2.2.8.1. Mini- und Maxipräparationen von Plasmid-DNA 20
2.2.8.2. Fragmentherstellung 20
2.2.8.3. Klonienmg von PCR-Produkten in den TOPO TA Vektor 20
2.2.8.4. Umklonierung von GR-Fragmenten in den pCR259-Vektor 21
2.2.8.4.1. Restriktionsenzymverdau 21
2.2.8.4.2. Ugalion und Transformation von GR-Fragment mit dem pCR259-Vektor 22
2.2.8.5. Das Transpose-Ad Adenovirale Vektor System 22
2.2.8.5.1. Transformation in HighQ-1 Transpose-Ad 294 kompetente Zellen 23
2.2.8.5.2. Transformation in HighQ-1 chemisch kompetente Zellen 23
2.2.8.53. Replikaplatten 24
2.2.8.5.4. Aufreinigung Pacl geschnittener Plasmid-DNA 24
INHALTSVERZEICHNIS n
2.2.8.6. Herstellung und Vennehrung der Viren in HEK293 Zellen 24
2.2.8.6.1. Transfektion der rekombinanten DNA in HEK293 Zellen 24
2.2.8.6.2. Herstellung von Zelllysaten 25
2.2.8.63. Virusampüfikation-. Reinfektionen in HEK293 Zellen 25
2.2.8.6.4. Virustiterbestimmung 26
2.2.9. Funktionstest der Konstrukte 27
2.2.9.1. Transiente Transfektion von Zelllinien mit Fu Gene 27
2.2.9.2. Infektion von primären Zellen (HSC, MFB) und Zelllinien
mit adenoviralen Konstrukten 27
2.2.9.3. Stimulation der Zellen 28
2.2.9.4. Herstellung von Zellextrakten 28
2.2.9.5. p-Galaktosidase-undLuziferase-Assay 2g
2.2.9.6. TGF-ßlELISA 2
3. Ergebnisse 30
3.1. GR- und Smad 3-Expression während der HSC Transdifferenzierung 30
3.1.1. Qualitativer Nachweis und mRNA Quantifizierung von endogenem GR und Smad 3 30
3.1.2. Einfluss von Dexamethason auf die GR- und Smad 3 Transkription 31
3.2. Wirkung der Kortikosteroide auf den TGF-ß-Smad-Signalweg 32
3.2.1. Dexamethason inhibiert die TGF-ßl,-ß2 und -ß3 mRNA Expression 32
3.2.2. TGF-ß Sekretion während der HSC Transdifferenzierung 33
3.2.3. Dexamethason inhibiert das TGF-ß-Smad 3 vermittelte Signal in HSC und CFSC . 34
3.3. Smad 2, 3 und 4 inhibieren die GR-Signaltransduktion 35
3.4. Herstellung rekombinanter Glukokortikoidrezeptor-Adenoviren 38
3.4.1. Klorderung von PCR-Produkten in den TOPO TA Vektor 38
3.4.2. Umklonienmg von GR Fragmenten in den pCR259 Vektor 39
3.4.3. Funknonskontrolle der rekombinanten Plasmide 40
3.4.4. Das Transpose-Ad Adenovirale Vektor System 41
3.4.4.1. Transformation in HighQ-1 Transpose-Ad294 kompetente Zellen 41
3.4.4.2. Transformation in HighQ-1 chemisch kompetente Zellen 41
3.4.4.3. Herstellung und Vermehrung der Viren in HEK293 Zellen 42
3.4.4.4. Virustiterbestimmung 43
3.4.5. Virusinfektion von HSC 43
3.5. Hcterogenität der Polyglutamin-Sequenz in verschiedenen Rattenstämmen 44
INHALTSVERZEICHNIS III
4. Diskussion 45
4.1. Kortikosteroide beeinflussen den TGF-ß-Smad 3-Signalweg 45
4.1.1. Dexamethason vermindert die TGF-ßl,-ß2 und -ß3 Isoform Transkription in HSC 45
4.1.2. Die TGF-ß Sekretion in aktivierten HSC wird durch Dexamethason reduziert 45
4.1.3. Dexamethason inhibiert das TGF-ß-Smad-Signal in HSC und CFSC 46
4.2. Intrazellulärer GR-Smad 3-Crosstalk 47
4.3. Adenovirale Konstrukte 50
4.4. Die Polyglutamin-Sequenz des GR variiert in verschiedenen Rattenstämmen 51
4.5. Therapieansätze der Fibröse - Zukunftsaussichten 52
5. Zusammenfassung 54
6. Literaturverzeichnis 55
7. Anhang 71
7.1. PCR-, LC- und Sequenzierprimer 71
7.2. Bakterien und Zelllinien 72
7.3. Plasmide und Konstrukte 72
8. Danksagung 76
9. Lebenslauf 77
|
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INHALTSVERZEICHNIS I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Pathogenese der Leberfibrose 1
1.2. Die TGF-ß-Signaltransduktion 3
1.3. Struktur und Funktion des Glukokortikoidrezeptors 5
1.4. Interaktion zwischen TGF-ß und GR-Signalwegen 8
1.5. Zielsetzung der Arbeit 10
2. Material und Methoden 11
2.1. Material 11
2.1.1. Chemikalien und Enzyme 11
2.1.2. Lösungen undPufler 12
2.1.3. Gele 12
2.1.4. Agarplatten, Zellkultur- und Bakterienmedien 12
2.2. Melhoden 13
2.2.1. Präparation von Hepatischen Stemzellen (HSC) aus der Rattenleber 13
2.2.2. Zellkultur von primären Zellen (HSC, MTB) und Zelllinien (CFSC, HEK293) 13
2.2.3. Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellkultur 14
2.2.4. DNA-Amplifikation (PCR) 14
2.2.5. DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung 16
2.2.6. Automatische Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA und Plasmid-DNA 16
2.2.7. mRNA Quantifizierung 18
2.2.7.1. In vitro Transkription 18
2.2.7.2. Reverse Transkription 18
2.2.8. Herstellung rekombinanter Glukokortikoidrezeptor-Adenoviren 20
2.2.8.1. Mini- und Maxipräparationen von Plasmid-DNA 20
2.2.8.2. Fragmentherstellung 20
2.2.8.3. Klonienmg von PCR-Produkten in den TOPO TA Vektor 20
2.2.8.4. Umklonierung von GR-Fragmenten in den pCR259-Vektor 21
2.2.8.4.1. Restriktionsenzymverdau 21
2.2.8.4.2. Ugalion und Transformation von GR-Fragment mit dem pCR259-Vektor 22
2.2.8.5. Das Transpose-Ad Adenovirale Vektor System 22
2.2.8.5.1. Transformation in HighQ-1 Transpose-Ad 294 kompetente Zellen 23
2.2.8.5.2. Transformation in HighQ-1 chemisch kompetente Zellen 23
2.2.8.53. Replikaplatten 24
2.2.8.5.4. Aufreinigung Pacl geschnittener Plasmid-DNA 24
INHALTSVERZEICHNIS n
2.2.8.6. Herstellung und Vennehrung der Viren in HEK293 Zellen 24
2.2.8.6.1. Transfektion der rekombinanten DNA in HEK293 Zellen 24
2.2.8.6.2. Herstellung von Zelllysaten 25
2.2.8.63. Virusampüfikation-. Reinfektionen in HEK293 Zellen 25
2.2.8.6.4. Virustiterbestimmung 26
2.2.9. Funktionstest der Konstrukte 27
2.2.9.1. Transiente Transfektion von Zelllinien mit Fu Gene 27
2.2.9.2. Infektion von primären Zellen (HSC, MFB) und Zelllinien
mit adenoviralen Konstrukten 27
2.2.9.3. Stimulation der Zellen 28
2.2.9.4. Herstellung von Zellextrakten 28
2.2.9.5. p-Galaktosidase-undLuziferase-Assay 2g
2.2.9.6. TGF-ßlELISA 2'
3. Ergebnisse 30
3.1. GR- und Smad 3-Expression während der HSC Transdifferenzierung 30
3.1.1. Qualitativer Nachweis und mRNA Quantifizierung von endogenem GR und Smad 3 30
3.1.2. Einfluss von Dexamethason auf die GR- und Smad 3 Transkription 31
3.2. Wirkung der Kortikosteroide auf den TGF-ß-Smad-Signalweg 32
3.2.1. Dexamethason inhibiert die TGF-ßl,-ß2 und -ß3 mRNA Expression 32
3.2.2. TGF-ß Sekretion während der HSC Transdifferenzierung 33
3.2.3. Dexamethason inhibiert das TGF-ß-Smad 3 vermittelte Signal in HSC und CFSC . 34
3.3. Smad 2, 3 und 4 inhibieren die GR-Signaltransduktion 35
3.4. Herstellung rekombinanter Glukokortikoidrezeptor-Adenoviren 38
3.4.1. Klorderung von PCR-Produkten in den TOPO TA Vektor 38
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3.4.4. Das Transpose-Ad Adenovirale Vektor System 41
3.4.4.1. Transformation in HighQ-1 Transpose-Ad294 kompetente Zellen 41
3.4.4.2. Transformation in HighQ-1 chemisch kompetente Zellen 41
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3.4.4.4. Virustiterbestimmung 43
3.4.5. Virusinfektion von HSC 43
3.5. Hcterogenität der Polyglutamin-Sequenz in verschiedenen Rattenstämmen 44
INHALTSVERZEICHNIS III
4. Diskussion 45
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4.2. Intrazellulärer GR-Smad 3-Crosstalk 47
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4.4. Die Polyglutamin-Sequenz des GR variiert in verschiedenen Rattenstämmen 51
4.5. Therapieansätze der Fibröse - Zukunftsaussichten 52
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7. Anhang 71
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