STAiR18 - eine STAT3-induzierte nicht-codierende RNA reguliert das Überleben von multiplen Myelomzellen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Elektronisch Software E-Book |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2014
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| Beschreibung: | VIII, 170 S. Ill., graph. Darst. 12 cm |
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 MOTIVATION 2
1.2 DIE LNTERLEUKIN-6-SIGNALTRANSDUKTION 2
1.2.1 DER IL-6-REZEPTOR: KLASSISCHES SIGNALING UND TRANSSIGNALING 2
1.2.2 DIE IL-6/JAK/STAT3-SIGNALKASKADE 3
1.3 DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR STAT3 4
1.3.1 STAT3-AUFBAU, -DOMAENEN UND -ISOFORMEN 4
1.3.2 STAT3-BINDUNGSSTELLEN IM GENOM 5
1.3.3 KLASSISCHE STAT3-ZIELGENE 5
1.4 IL-6 UND STAT3 IM MULTIPLES MYELOM 6
1.5 EPIGENETIK 6
1.5.1 DIE STRUKTUR DES CHROMATINS 7
1.5.2 DIE MODIFIKATION DES CHROMATINS 7
1.6 NICHT-CODIERENDE RNAS 9
1.6.1 KLASSIFIZIERUNG VON NCRNAS 9
1.6.2 NCRNAS REGULIEREN DEN IL-6/JAK/STAT3-SIGNALWEG 11
1.6.3 LNCRNAS REGULIEREN EPIGENETISCHE PROZESSE 11
1.6.4 MOEGLICHKEITEN DER FUNKTIONELLE ANALYSE VON INCRNAS 12
1.7 ZIELSTELLUNG 13
2 MATERIAL UND METHODEN 14
2.1 ZELLKULTURTECHNIKEN 14
2.1.1 ZELLKULTUR 14
2.1.2 IL-6-ENTZUG UND -RESTIMULATION DER INA-6-ZELLEN 14
2.1.3 TRANSIENTETRANSFEKTION 14
2.1.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 16
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 17
2.2.1 KERN-ZYTOPLASMAPRAEPARATION 17
2.2.2 DNA-PRAEPARATION 17
2.2.3 RNA-PRAEPARATION 17
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2.2.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 18
2.2.5 REVERSE TRANSKRIPTION 18
2.2.6 STANDARD-PCR UND VISUALISIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 19
2.2.7 QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR 20
2.2.8 KLONIERUNG 23
2.3 PROTEINBIOCHEMIE 26
2.3.1 PROTEINPRAEPARATION UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 26
2.3.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKROPHORESE 27
2.3.3 IMMUNBLOT 28
2.3.4 GELFAERBETECHNIKEN 29
2.4 PRAEZIPITATION VON PROTEINEN UND NUKLEINSAEUREN 30
2.4.1 CHROMATIN-IMMUNPRAEZIPITATION 30
2.4.2 RNA-IMMUNPRAEZIPITATION 31
2.4.3 CHROMATIN-LSOLATION-BY-RNA-PURIFICATION 32
2.4.4 CAPTURE 34
2.5 GLOBALE ANALYSEN 34
2.5.1 TRANSKRIPTOMANALYSE (MICROARRAY) 34
2.5.2 GENOMWEITE SEQUENZIERUNG VON RNA 35
2.5.3 GENOMWEITE SEQUENZIERUNG VON DNA 35
2.5.4 PROTEOMANALYSE MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE 36
2.6 DATENVERARBEITUNG UND STATISTIK 36
3 ERGEBNISSE 38
3.1 CHARAKTERISIERUNG DER MULTIPLEN MYELOMZELLLINIE INA-6 38
3.1.1 INA-6-ZELLEN SIND IL-6-ABHAENGIG 38
3.1.2 IL-6 AKTIVIERT DIE JAK/STAT3-SIGNALKASKADE 39
3.1.3 IL-6-INDUZIERTE UND STAT3-REGULIERTE GENEXPRESSION 40
3.2 IL-6-INDUZIERTE UND STAT3-REGULIERTE NCRNAS 40
3.2.1 IDENTIFIZIERUNG STAT3-INDUZIERTER INCRNAS 41
3.2.2 VALIDIERUNG DER IL-6-INDUZIERTEN STAIR-EXPRESSION 42
3.2.3 VALIDIERUNG DER STAT3-ABHAENGIGEN STAIR-EXPRESSION 42
3.2.4 SUBZELLULAERE LOKALISATION DER STAIRS 43
3.2.5 CHROMATINASSOZIATION DER STAIRS 44
3.3 CHARAKTERISIERUNG DER INCRNA STAIR18 45
3.3.1 ANALYSE VON STAIR18 IM GENOMISCHEN KONTEXT 46
IV
3.3.2 ANALYSE DER STAIR18-EXPRESSION VON BEIDEN GENOMISCHEN LOCI 47
3.3.3 INA-6-SPEZIFISCHE SEQUENZANALYSE DER LOCUSSPEZIFISCHEN
STAIR18-VARIANTEN 49
3.3.4 STAIR18 HAT MRNA CHARAKTER 51
3.3.5 ANALYSE VON MOEGLICHEN STAIR18-SPEZIFISCHEN ORFS 53
3.3.6 ANALYSE DERSTAIR18-SEKUNDAERSTRUKTUR 55
3.3.7 STAIR18 WIRD ALTERNATIV GESPLEISST 57
3.3.8 EXPRESSION VON STAIR18 ANTISENSE-TRANSKRIPTEN 71
3.4 STAIR18-KNOCKDOWN-STUDIEN 72
3.4.1 BESTIMMUNG DER RNAI-VERMITTELTEN STAIR18-KNOCKDOWNEFFIZIENZ 73
3.4.2 STAIR18-KNOCKDOWNEFFEKTE AUF DIE STAT3-PROTEINEXPRESSION 74
3.4.3 ANALYSE DER STAIR18-VERMITTELTEN REGULATION VON STAT3 75
3.4.4 ANALYSE DES STAIR18-KNOCKDOWNS AUF DIE VITALITAET DER INA-6-ZELLEN
80
3.4.5 REKONSTITUTION DER STAIR18-REGULIERTEN ZELLVITALITAET 81
3.4.6 EINFLUSS VON STAIR18 AUF DIE PROLIFERATION DER INA-6-ZELLEN 83
3.4.7 GENOMWEITE IDENTIFIZIERUNG STAIR18-REGULIERTER GENE 84
3.5 IDENTIFIZIERUNG VON STAIR18-LNTERAKTIONSPARTNERN 90
3.5.1 VORSTELLUNG DER CHIRP-METHODE 91
3.5.2 SPEZIFISCHE ANREICHERUNG VON STAIR18-RNA MITTELS CHIRP 92
3.5.3 COPRAEZIPITATION STAIR18-ASSOZIIERTER RNA 96
3.5.4 COPRAEZIPITATION STAIR18-ASSOZIIERTER DNA 102
3.5.5 COPRAEZIPITATION STAIR18-ASSOZIIERTER PROTEINE 110
4 DISKUSSION 119
4.1 REGULATION DER ZELLPHYSIOLOGIE UND DES ZELLZYKLUS 119
4.2 REGULATION VON CHROMATINZUSTAENDEN 122
4.3 REGULATION DER TRANSKRIPTION 124
4.4 POSTTRANSKRIPTIONELLE REGULATION 128
4.5 REGULATION DER TRANSLATION 130
4.6 REGULATION VON STAIR18 IN ZELLULAEREN KOMPARTIMENTEN 131
4.7 ERKENNUNG REPETITIVER SEQUENZEN DURCH STAIR18 133
4.8 SCHLUSSFOLGERUNG 134
5 ZUSAMMENFASSUNG 136
6 SUMMARY 138
LITERATURVERZEICHNIS 140
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 148
V
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