Einsatz synthetischer Peptide im ELISA zum Nachweis von Gliadinantikörpern im Rahmen der Zöliakiediagnostik:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einführung 1
1.1. Definition der Zöliakie 1
1.2. Historische Aspekte 1
1.3. Prävalenz der Zöliakie 2
1.4. Ätiologie und Pathogenese 3
1.5. Klinik, Diagnostik und Therapie 9
1.6. Komplikationen und Folgen der Zöliakie 15
1.7. Assoziierte Krankheitsbilder 16
1.8. Ziel dieser Arbeit 17
2. Material und Methoden 19
2.1. Chemikalien 19
2.2. Lösungen und Puffer 19
2.3. Humane Seren und Peptide 21
2.4. ELISA mit Ni NTA Hissorp Platte 22
2.5. ELISA auf Poly Maxisorp Platte mit His tag Peptiden 25
2.6. ELISA mit streptavidinbeschichteter Platte 26
2.7. ELISA mit DNA Bind Platte 27
2.8. Lumineszenzassay mit auf Zellulosemembranen synthetisierten Peptiden 29
2.9. ELISA zur Bestimmung von Gliadinantikörpern 30
2.10. Immunfluoreszenzassay zur Bestimmung von Endomysiumantikörpem auf
Kryostatschnitten des Affenösophagus 31
2.11. ELISA zur Bestimmung von Transglutaminaseantikörpern 31
2.12. ELISA zur Bestimmung von BSA Antikörpern 32
2.13. Statistische Verfahren 32
3. Ergebnisse 33
3.1. Entwicklung eines ELISA zur Bestimmung von Gliadinantikörpern mit
synthetischen Peptiden 33
3.1.1. Bindung der Peptide an Ni NTA Hissorp Platten 33
3.1.2. Bindung der His tag Peptide an Poly und Maxisorp Platten 39
3.1.3. Bindung biotinylierter Peptide an mit Streptavidin beschichtete Platten 40
3.1.4. Bindung der Peptide an DNA Bind Platten 42
3.2. Reaktivität humaner Seren mit synthetischen Peptiden im ELISA 44
3.2.1. Reaktivität mit Pep 1 und Pep 2 44
3.2.2. Reaktivität mit Pep 3 und Pep 4 50
3.3. Reaktivität humaner Seren mit synthetischen Peptiden im Lumineszenzassay
auf Zellulosemembranen 53
4. Diskussion 57
5. Zusammenfassung 69
6. Literaturverzeichnis 73
7. Anhang 89
7.1. Tabellenverzeichnis 89
7.2. Abbildungsverzeichnis 91
7.3. Verzeichnis der Originaldaten 92
7.4. Veröffentlichung 98
7. Anhang
7.1. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Stadien der Zöliakie nach Marsh Seite 11
Tabelle 2: Diagnostische Sensitivität und Spezifität verschiedener serologi Seite 13
scher Tests bei der Zöliakiediagnostik nach Literaturangabe
(Rijkers et al. 2003)
Tabelle 3: Verwendete Lösungen und Puffer Seite 19
Tabelle 4: Verwendete Seren mit Diagnoseschlüssel Seite 21
Tabelle 5: Einfluss von H2SO4 und der Zeit auf die Farbentwicklung auf den Seite 34
Ni NTA Hissorp Platten
Tabelle 6: Einfluss der Vorinkubation von Seren und zweitem Antikörper mit Seite 36
BSA auf die Farbentwicklung auf den Ni NTA Hissorp Platten
Tabelle 7: IgA Gliadinantikörperkonzentration nach Vorbehandlung der Se Seite 37
ren mit und ohne BSA
Tabelle 8: Vergleich der Bindung von Antikörpern zweier Seren an Pep 1 Seite 40
und Pep 2 bei unterschiedlichen Peptidverdünnungen auf Maxi
sorp Platten
Tabelle 9: Vergleich der Bindung von Antikörpern verschiedener Seren an Seite 41
Pep 1, Pep 2 und an das Peptid aus Leiden auf der mit Streptavidin
beschichteten Platte
Tabelle 10: Vergleich der Bindung von IgA verschiedener Seren an Pep 1 und Seite 42
Pep 2 auf DNA Bind Platten
Tabelle 11: Diagnostische Sensitivität und Spezifität des Peptid ELISA auf Seite 46
DNA Bind Platten bei einem Grenzwert von 0,025
Tabelle 12: Intra Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 1 und Seite 47
Pep 2 im Peptid ELIS A auf DNA Bind Platten
Tabelle 13: Inter Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 1 und Seite 47
Pep 2 im Peptid ELISA auf DNA Bind Platten
89
Tabelle 14: Endomysiumantikörper sowie IgA und IgG Gliadinantikörper Seite 48
konzentrationen der im Versuch zur Reaktivität von IgG
Gliadinantikörper mit Pep 1 und Pep 2 verwendeten Seren
Tabelle 15: Vergleich der Bindung von IgG Antikörpern zweier Seren an Pep Seite 49
1 und Pep 2 bei unterschiedlicher Verdünnungen des zweiten An¬
tikörpers im ELISA auf DNA Bind Platten
Tabelle 16: Intra Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 3 und Seite 52
Pep 4 im Peptid ELISA auf DN A Bind Platten
Tabellel7: Inter Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 3 und Seite 53
Pep 4 im Peptid ELISA auf DNA Bind Platten
Tabelle 18: Reaktivität humaner Seren mit auf Zellulosemembran synthetisier Seite 54
ten Peptide gemessen im Lumineszenzassay
Tabelle 19: Diagnostische Sensitivität, Spezifität und Effizienz serologischer Seite 66
Tests zur Zöliakiediagnostik im Vergleich zum Peptid ELISA mit
Pep 1 und Pep 2
90
7.2. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Bindung der Peptide an die Ni NTA Hissorp Platte Seite 22
Abbildung 2: Bindung von biotingekoppelten Peptiden an Streptavidin Seite 26
Abbildung 3: Bindung der Peptide an die DNA Bind Platte Seite 27
Abbildung 4: Reaktivität humaner Seren mit den Peptiden Pep 1 und Pep 2 auf Seite 45
DNA Bind Platten
Abbildung 5: Reaktivität humaner Seren mit den Peptiden Pep 3 und Pep 4 auf Seite 51
DNA Bind Platten
Abbildung 6: Korrelation der Extinktionsdifferenzen im ELISA auf DNA Seite 55
Bind Platten mit den Differenzen der Lumineszenzergebnisse im
Lumineszenzassay bezüglich Pep 1 und Pep 2
Abbildung 7: Reaktivität von IgA von Zöliakiepatientenseren (Patientengrup Seite 60
pen 01 /04) mit den synthetischen Peptiden Pep 1 und Pep 2 und
Vergleich mit anderen Antikörperbestimmungen
Abbildung 8: Reaktion von Zöliakiepatientenseren und Kontrollseren, die eine Seite 64
IgA Gliadinantikörperkonzentration von über 30 U aufweisen,
mit den synthetischen Peptiden Pep 1 und Pep 2 im Peptid
ELISA auf DNA Bind Platten
Abbildung 9: Korrelation der Differenzen der Lumineszenzergebnisse im Lu Seite 65
mineszenzassay von Schwertz (2004) mit Extinktionsdifferenzen
im ELISA auf DNA Bind Platten bezüglich Pep 1 und Pep 2
91
|
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Inhaltsverzeichnis
1. Einführung 1
1.1. Definition der Zöliakie 1
1.2. Historische Aspekte 1
1.3. Prävalenz der Zöliakie 2
1.4. Ätiologie und Pathogenese 3
1.5. Klinik, Diagnostik und Therapie 9
1.6. Komplikationen und Folgen der Zöliakie 15
1.7. Assoziierte Krankheitsbilder 16
1.8. Ziel dieser Arbeit 17
2. Material und Methoden 19
2.1. Chemikalien 19
2.2. Lösungen und Puffer 19
2.3. Humane Seren und Peptide 21
2.4. ELISA mit Ni NTA Hissorp Platte 22
2.5. ELISA auf Poly Maxisorp Platte mit His tag Peptiden 25
2.6. ELISA mit streptavidinbeschichteter Platte 26
2.7. ELISA mit DNA Bind Platte 27
2.8. Lumineszenzassay mit auf Zellulosemembranen synthetisierten Peptiden 29
2.9. ELISA zur Bestimmung von Gliadinantikörpern 30
2.10. Immunfluoreszenzassay zur Bestimmung von Endomysiumantikörpem auf
Kryostatschnitten des Affenösophagus 31
2.11. ELISA zur Bestimmung von Transglutaminaseantikörpern 31
2.12. ELISA zur Bestimmung von BSA Antikörpern 32
2.13. Statistische Verfahren 32
3. Ergebnisse 33
3.1. Entwicklung eines ELISA zur Bestimmung von Gliadinantikörpern mit
synthetischen Peptiden 33
3.1.1. Bindung der Peptide an Ni NTA Hissorp Platten 33
3.1.2. Bindung der His tag Peptide an Poly und Maxisorp Platten 39
3.1.3. Bindung biotinylierter Peptide an mit Streptavidin beschichtete Platten 40
3.1.4. Bindung der Peptide an DNA Bind Platten 42
3.2. Reaktivität humaner Seren mit synthetischen Peptiden im ELISA 44
3.2.1. Reaktivität mit Pep 1 und Pep 2 44
3.2.2. Reaktivität mit Pep 3 und Pep 4 50
3.3. Reaktivität humaner Seren mit synthetischen Peptiden im Lumineszenzassay
auf Zellulosemembranen 53
4. Diskussion 57
5. Zusammenfassung 69
6. Literaturverzeichnis 73
7. Anhang 89
7.1. Tabellenverzeichnis 89
7.2. Abbildungsverzeichnis 91
7.3. Verzeichnis der Originaldaten 92
7.4. Veröffentlichung 98
7. Anhang
7.1. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Stadien der Zöliakie nach Marsh Seite 11
Tabelle 2: Diagnostische Sensitivität und Spezifität verschiedener serologi Seite 13
scher Tests bei der Zöliakiediagnostik nach Literaturangabe
(Rijkers et al. 2003)
Tabelle 3: Verwendete Lösungen und Puffer Seite 19
Tabelle 4: Verwendete Seren mit Diagnoseschlüssel Seite 21
Tabelle 5: Einfluss von H2SO4 und der Zeit auf die Farbentwicklung auf den Seite 34
Ni NTA Hissorp Platten
Tabelle 6: Einfluss der Vorinkubation von Seren und zweitem Antikörper mit Seite 36
BSA auf die Farbentwicklung auf den Ni NTA Hissorp Platten
Tabelle 7: IgA Gliadinantikörperkonzentration nach Vorbehandlung der Se Seite 37
ren mit und ohne BSA
Tabelle 8: Vergleich der Bindung von Antikörpern zweier Seren an Pep 1 Seite 40
und Pep 2 bei unterschiedlichen Peptidverdünnungen auf Maxi
sorp Platten
Tabelle 9: Vergleich der Bindung von Antikörpern verschiedener Seren an Seite 41
Pep 1, Pep 2 und an das Peptid aus Leiden auf der mit Streptavidin
beschichteten Platte
Tabelle 10: Vergleich der Bindung von IgA verschiedener Seren an Pep 1 und Seite 42
Pep 2 auf DNA Bind Platten
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DNA Bind Platten bei einem Grenzwert von 0,025
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Pep 2 im Peptid ELIS A auf DNA Bind Platten
Tabelle 13: Inter Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 1 und Seite 47
Pep 2 im Peptid ELISA auf DNA Bind Platten
89
Tabelle 14: Endomysiumantikörper sowie IgA und IgG Gliadinantikörper Seite 48
konzentrationen der im Versuch zur Reaktivität von IgG
Gliadinantikörper mit Pep 1 und Pep 2 verwendeten Seren
Tabelle 15: Vergleich der Bindung von IgG Antikörpern zweier Seren an Pep Seite 49
1 und Pep 2 bei unterschiedlicher Verdünnungen des zweiten An¬
tikörpers im ELISA auf DNA Bind Platten
Tabelle 16: Intra Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 3 und Seite 52
Pep 4 im Peptid ELISA auf DN A Bind Platten
Tabellel7: Inter Assay Variation der Extinktionsmessungen für Pep 3 und Seite 53
Pep 4 im Peptid ELISA auf DNA Bind Platten
Tabelle 18: Reaktivität humaner Seren mit auf Zellulosemembran synthetisier Seite 54
ten Peptide gemessen im Lumineszenzassay
Tabelle 19: Diagnostische Sensitivität, Spezifität und Effizienz serologischer Seite 66
Tests zur Zöliakiediagnostik im Vergleich zum Peptid ELISA mit
Pep 1 und Pep 2
90
7.2. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Bindung der Peptide an die Ni NTA Hissorp Platte Seite 22
Abbildung 2: Bindung von biotingekoppelten Peptiden an Streptavidin Seite 26
Abbildung 3: Bindung der Peptide an die DNA Bind Platte Seite 27
Abbildung 4: Reaktivität humaner Seren mit den Peptiden Pep 1 und Pep 2 auf Seite 45
DNA Bind Platten
Abbildung 5: Reaktivität humaner Seren mit den Peptiden Pep 3 und Pep 4 auf Seite 51
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Abbildung 6: Korrelation der Extinktionsdifferenzen im ELISA auf DNA Seite 55
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Lumineszenzassay bezüglich Pep 1 und Pep 2
Abbildung 7: Reaktivität von IgA von Zöliakiepatientenseren (Patientengrup Seite 60
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Vergleich mit anderen Antikörperbestimmungen
Abbildung 8: Reaktion von Zöliakiepatientenseren und Kontrollseren, die eine Seite 64
IgA Gliadinantikörperkonzentration von über 30 U aufweisen,
mit den synthetischen Peptiden Pep 1 und Pep 2 im Peptid
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Abbildung 9: Korrelation der Differenzen der Lumineszenzergebnisse im Lu Seite 65
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