Der Antiterminations-Komplex aus Escherichia coli: Expression, Struktur und Funktion des NusB-Proteins
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Utz, Wiss.
1998
|
| Schriftenreihe: | Biochemie
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 1998 |
| Beschreibung: | XII, 248 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3896754467 |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
TERMINATION
UND
ANTITERMINATION
.
1
1.1.1
TRANSKRIPTIONSTERMINATION
BEI
PROKARYONTEN
.
1
1.1.2
RHO-UNABHAENGIGE
TERMINATION
.
2
1.1.3
RHO-ABHAENGIGE
TERMINATION
.
4
1.2
ANTITERMINATION
UND
DER
BAKTERIOPHAGE
LAMBDA
.
5
1.2.1
DER
BAKTERIOPHAGE
LAMBDA
.
6
1.2.2
DIE
GENETISCHE
ORGANISATION
DES
BAKTERIOPHAGEN
LAMBDA
.
7
1.2.3
DIE
LYTISCHE
KASKADE
.
10
1.2.4
LYSOGENE
ENTWICKLUNG
.
11
1.3
DIE
YYNUT-SLTE
"
IM
BAKTERIOPHAGEN
LAMBDA
.
12
1.3.1
ANTITERMINATION
IN
VERBINDUNG
MIT
X-N-PROTEIN
BEDARF
EINER
YYNUT-SITE
"
.
12
1.3.2
DIE
X-N-ABHAENGIGE
TRANSLATIONALE
REPRESSION
DES
EIGENEN
GENS
IST
VON
DER
YYNUT-SITE
"
ABHAENGIG
.
14
1.4
X-N
VERMITTELTE
ANTITERMINATION
.
15
1.4.1
ALLGEMEINES
ZUM
N-ANTITERMINATIONSKOMPLEX
.
15
1.4.2
WECHSELWIRKUNGEN
DER
EINZELNEN
KOMPONENTEN
DES
KOMPLEXES
.
16
1.5
ANTLTERMLNATLON
IN
RNA
(RRN)
OPERONS
.
23
1.5.1
ANALOGIEN
ZWISCHEN
DER
N-VERMITTELTEN
UND
DER
RIBOSOMAIEN
ANTITERMINATION
.
23
1.5.2
ENTDECKUNG
DER
RIBOSOMAIEN
BOXA-ELEMENTE
.
25
1.5.3
BEDEUTUNG
ANTITERMINATION
IM
RRN-SYSTEM
.
25
1.5.4
BETEILIGUNG
VON
NUS-PROTEINEN
AN
DER
RIBOSOMAIEN
ANTITERMINATION.
.26
1.6
E.
CO//-PROTELNE,
DIE
AN
DER
ANTITERMINATION
BETEILGT
SIND:
NUS-PROTEINE.
28
1.6.1
ENTDECKUNG
DER
NUS-PROTEINE
AUS
ESCHERICHIA
COLI
.
28
1.6.2
EIGENSCHAFTEN
DES
NUSB-GENS
UND
-PROTEINS
.
29
1.6.3
EIGENSCHAFTEN
DES
RPSJ-GENS
UND
DES
S10-PROTEINS
.
32
1.6.4
WECHSLEWIRKUNG
ZWISCHEN
NUSB
UND
S10-PROTEIN
.
34
1.6.5
WECHSELWIRKUNG
DER
NUS-PROTEINE
MIT
RNA
.
35
1.6.6
WECHSELWIRKUNG
VON
S1-PROTEIN
MIT
RM
BOXA-RNA
.
37
1.7
BEZIEHUNG
DES
NUSB-GENS
ZU
GENEN
DER
RIBOFLAVIN-BIOSYNTHESE
.
40
1.8
PARALLELEN
DES
X-N-PROTELNS
UND
DER
E.
COLI
NUS-PROTELNE
ZUM
TAT
BZW.
REV-PROTELN
AUS
DEM
HIV-VIRUS
.
41
1.8.1
WECHSELWIRKUNG
VON
HIV
TAT-PROTEIN
MIT
TAR-RNA
.
41
1.8.2
WECHSELWIRKUNG
VON
HIV
REV-PROTEIN
MIT
RRE-RNA
.
43
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
45
2.1
GERAETE
.
45
2.2
CHEMIKALIEN
.
48
2.3
OLLGONUKLEOTIDE
.
2.4
ENZYME
.
2.5
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
49
2.6
MEDIEN
FUER
BAKTERIENKULTUREN
.
61
2.7
MIKROORGANISMEN
.
64
2.7.1
ANZUCHT
VON
MIKROORGANISMEN
.
64
2.7.2
STAMMHALTUNG
.
65
2.8
STAEMME
UND
PLASMIDE
.
65
2.9
PLASMIDISOLIERUNG
.
66
2.9.1
SCHNELLISOLIERUNG
DURCH
HITZESCHOCK
.MINIPRAEPARATION
"
.
66
2.9.2
T
RITON-LYSOZYM-METHODE
MIT
YYNUCLEOBOND
R
YY^
.
67
2.9.3
PLASMIDISOLIERUNG
MITTELS
YYQIAGEN
R
YY-KIT
"
.
68
2.9.4
PLASMIDISOLIERUNG
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
.
68
2.10
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA-HALTIGEN
LOESUNGEN
.
69
2.10.1
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
69
2.10.2
FLUOROMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
70
2.11
REINIGUNG
VON
DNA
.
71
2.11.1
REINIGUNG
VON
DNA
MIT
YYGENECLEAN
RTM
"
.
71
2.11.2
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
BZW.
PCR
REAKTIONSANSAETZEN
.
71
2.11.3
FAELLEN
VON
DNA
.
72
2.12
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
72
2.13
RESTRIKTION
UND
LIGATLON
.
74
2.13.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
74
2.13.2
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
74
2.14
KOMPETENTE
ZELLEN
UND
TRANSFORMATION
.
75
2.14.1
HERSTELLUNG
CHEMISCHE
KOMPETENTER
ZELLEN
NACH
HANAHAN
(1985).
75
2.14.2
CHEMISCHE
TRANSFORMATION
NACH
HANAHAN
(1985)
.
76
2.14.3
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
.
76
2.14.4
ELEKTROTRANSFORMATION
.
77
2.15
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
77
2.16
DNA-SEQUENZIERUNG
.
79
2.17
TESTANZUCHT
MIT
SDS-AUFSCHLUSS
.
81
2.18
SDS
-
POLYACRYLAMID
-
GELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
82
2.18.1
ALLGEMEINES
.
82
2.18.2
SDS-PAGE
MIT
GLYCINAT
ALS
LEITION
.
84
2.18.3
SDS-PAGE
MIT
TRICINAT
ALS
LEITION
.
85
2.18.4
FAERBUNG
.
86
2.19
PRAEPARATIVE
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
86
2.20
ANZUCHT
IN
PRAEPARATIVEM
MASSSTAB
UND
ULTRASCHALLAUFSCHLUSS
.
87
2.21
PROTEINBESTIMMUNG
.
87
2.22
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
.
88
VIII
2.23
WESTEM-BLOTTING
.
89
2.23.1
ELEKTROBLOTTING
AUF
PVDF-MEMBRAN
.
89
2.23.2
ANTIKOERPERREAKTIONEN
.
90
2.23.3
NACHWEISREAKTION
.
90
2.24
ELISA-TEST
.
91
2.24.1
BESCHICHTUNG
VON
ELISA-PLATTEN
.
91
2.24.2
ANTIKOERPERREAKTIONEN
.
92
2.24.3
DETEKTIONSREAKTIONEN
.
92
2.25
PROTEINREINIGUNG
.
93
2.25.1
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
93
2.25.2
GELPERMEATIONS-CHROMATOGRAPHIE
.
93
2.25.3
PROTEINKONZENTRATION
DURCH
ULTRAFILTRATION
.
94
2.26
PROTELNRENIGUNG
DURCH
NLCKELCHELAT
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
94
2.26.1
VORVERSUCHE
UNTER
NATIVEN
BZW.
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
95
2.26.2
FPLC-REINIGUNG
MIT
NICKELCHELAT-AFFINITAETSMATERIAL
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
95
2.27
ANALYTISCHE
ULTRAZENTRIFUGE
.
96
2.28
PROTEINSEQUENZIERUNG
.
96
3
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.99
3.1
KONSTRUKTION
EINES
NUSB-EXPRESSIONSKLONES
.
99
3.1.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
UND
RESTRIKTION
.
99
3.1.2
SUBKLONIERUNG
IN
DEN
VEKTOR
PBLUESCRIPT
II
SK(-)
UND
SS-GALACTOSIDASE
-
SELEKTION
.102
3.1.3
AUFBAU
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
PNCO113
.103
3.1.4
KLONIERUNG
DES
NUSB-GENS
IN
DEN
VEKTOR
PNCO113
.
105
3.1.5
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
.106
3.1.6
TESTEN
AUF
LOESLICHES
PROTEIN:
EINSCHLUSSKOERPER
.107
3.2
DETEKTIONSSYSTEM
FUER
DAS
NUSB-PROTELN
.
109
3.2.1
REINIGUNG
DER
NUSB-EINSCHLUSSKOERPER
MIT
PRAEPARATIVER
GELELEKTRO
PHORESE
.
110
3.2.2
ANSEQUENZIERUNG
DES
GEREINIGTEN
NUSB-PROTEINS
.110
3.2.3
IMMUNISIERUNG,
BESTIMMUNG
DES
SERUM-TITERS
.
111
3.2.4
WESTERN-BLOT
.112
3.3
KONSTRUKTION
VON
NEUEN
NUSB-EXPRESSIONSKLONEN
.
114
3.3.1
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
P602/22-NUSB
.
116
3.3.2
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PACYCL
84-NUSB
.
117
3.3.3
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PNCO(GTG)-NUSB
.
118
3.3.4
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PLACP(GTG)-NUSB
.120
3.3.5
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PNCO(ATG)-HI-NUSB
AUS
DNA
VON
HAEMOPHILUS
INFLUENZAE
.123
3.4
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
NUSB-PROTEINS
.
124
3.4.1
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.125
3.4.2
ULTRAFILTRATION
.
127
3.4.3
GELPERMEATIONS-CHROMATOGRAPHIE
.127
IX
3.4.4
REINIGUNG
DES
NUSB-PROTEINS
AUS
HAEMOPHILUS
INFLUENZAE
.130
3.4.5
PROTEIN-REINIGUNG
UND
-EXPRESSION:
VERGLEICH
DER
METHODEN
UND
AUSBEUTEN
.
130
3.4.6
STABILITAETSUNTERSUCHUNG
UND
LAGERUNG
.138
3.4.7
MASSENSPEKTROMETRIE
.
140
3.4.8
SEQUENZIERUNG
DES
GEREINIGTEN
NUSB-PROTEINS
.140
3.4.9
BESTIMMUNG
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTS
DURCH
ANALYTISCHE
ULTRAZENTRIFUGATION
.142
3.5
ANZUCHT
MIT
MARKIERTEN
MEDIEN
.
147
3.5.1
ANZUCHT
VON
UNMARKIERTEN
ZELLEN
.147
3.5.2
MARKIERUNG
MIT
15
N-NH
4
CI
.148
3.5.3
MARKIERUNG
MIT
15
N-NH
4
CI
UND
[U
13
CG]-GLUCOSE
UND
[U
13
C,
'
5
N]
PROTEINHYDROLYSAT
.
148
3.5.4
MARKIERUNG
MIT
[U
13
C,
18
N,
75%
2
H]-PROTEINHYDROLYSAT
.
148
3.5.5
MARKIERUNG
MIT
20%
[U
13
C6]-GLUCOSE
.149
3.6
VERBESSERTE
QUALLAET
DER
NMR-SPEKTREN
DURCH
MARKIERTE
PROTEINE
.
149
3.6.1
ALLGEMEINES
.149
3.6.2
ZUORDNUNG
DER
METHYLGRUPPEN
VON
VALIN
UND
LEUCIN
DURCH
20%
13
CG-GLUCOSE-MARKIERUNG
.150
3.6.3
STEREOSPEZIFISCHE
ZUORDNUNG
DER
AMID-PROTONEN
VON
ASPARAGIN
UND
GLUTAMIN-RESTEN
IN
13
C,
N-MARKIERTEN
PROTEINEN
.155
3.7
EINFLUSS
DER
MARKIERUNG
MIT
DEUTERIUM
AUF
DIE
QUALITAET
DER
NMR
SPEKTREN
.
158
3.7.1
SIGNAL-RAUSCH-VERHAELTNIS
UND
RELAXATIONSRATEN
.158
3.7.2
GRAD
DER
DEUTERIERUNG
.160
3.8
VERBESSERTE
ZUORDNUNG
DER
SIGNALE
DURCH
DEUTERIERTES
PROTEIN
.
161
3.8.1
ZUORDNUNG
DER
RUECKGRATSIGNALE
.
161
3.8.2
ZUORDNUNG
DER
SEITENKETTENSIGNALE
.169
3.9.
STRUKTURAUFKLAERUNG
.
172
3.9.1
SEKUNDAERSTRUKTUR
.
172
3.9.2
TERTIAERSTRUKTUR
.
177
3.10
KOMPLEXBILDUNG
ZWISCHEN
NUSB-PROTEIN
UND
RRN
BOXA-RNA
.
185
3.10.1
BINDUNG
VON
RM
BOXA-RNA
AN
NUSB-PROTEIN
.
186
3.10.2
VERGLEICH
VON
FREIEM
UND
RNA-GEBUNDENEM
PROTEIN
.189
3.11
STRUKTURDISKUSSION
.
190
3.11.1
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
DNA
UND
RNA-ERKENNUNG
DURCH
PROTEINE.
190
3.11.2
YYADAPTIVE
BINDING
"
,
YYARGININE
RICH
MOTIF
"
UND
YYARGININE
FORK
"
SIND
CHARAKTERISTISCH
FUER
DIE
RNA-BINDUNG
.
191
3.11.3
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
X
N-PROTEIN
UND
BOXB-RNA
.193
3.11.4
WECHSELWIRKUNG
VON
P22
N-PEPTID
MIT
BOXB-RNA
.
195
3.11.5
WECHSELWIRKUNG
VON
BIV
TAT-PROTEIN
MIT
TAR-RNA
.196
3.11.6
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
REV-PROTEIN
UND
RRE-RNA
.198
3.12
KLONIERUNG,
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
NUSE/S10-PROTELNS
AUS
ESCHERICHIA
COLI.
.
200
3.12.1
KLONIERUNG
DES
RPSJ-GENS
AUS
ESCHERICHIA
COLI
.
200
3.12.2
DETEKTION
DES
NUSE/S10-PROTEINS
.
202
X
3.12.3
REINIGUNG
DES
NUSE-PROTEINS
AUS
NICKELCHELAT-AFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE
.
202
3.12.4
SEQUENZIERUNG
DES
NUS-HIS6-PROTEINS
.
204
4
ZUSAMMENFASSUNG
.
207
5
LITERATUR
.
211
6
ABBILDUNGSNACHWEIS
.
247
XI |
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| author | Berglechner, Fabian Werner |
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