Untersuchungen zur Apoptose: Charakterisierung von mDAP-3, eines pro-apoptotischen, konservierten, mitochondrialen Proteins
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
_
1
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
UND
EINHEITEN
.
4
ZUSAMMENFASSUNG
6
1
EINLEITUNG
_
8
1.1
A
LLGEMEINE
B
EDEUTUNG
DER
A
POPTOSE
.
8
1.2
K
ONTROLLE
DER
A
POPTOSE
.
8
1.2.1
APOPTOSEKONTROLLE
BEI
C.
ELEGANS
.
9
1.2.2
CASPASEN
.
10
1.2.3
AKTIVIERUNG
VON
CASPASEN,
SIGNALTRANSDUKTION
IN
DER
APOPTOSE
.
12
1.2.4
BCL-2
FAMILIENMITGLIEDER
UND
APOPTOSE
.14
1.2.5
ZWEI
UNTERSCHIEDLICHE
APOPTOTISCHE
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE
.
16
1.3
APOPTOSE
UND
MITOCHONDRIEN
.
18
1.3.1
UEBERBLICK
UEBER
DIE
MITOCHONDRIALE
PHYSIOLOGIE
UND
STRUKTUR
.
18
1.3.2
MITOCHONDRIEN
ALS
RESERVOIR
PRO-APOPTOTISCHER
PROTEINE
.
21
1.3.3
DER
PERMEABIHTY
TRANSITION
PORE
KOMPLEX
.
22
1.4
I
SOLIERUNG
(E
NTDECKUNG
)
VON
MERM
-3
UND
DAP
-3
.25
1.4.1
ISOLIERUNG
NEUER
MURINER
EMBRYONALER
NIEREN-MARKER
GENPRODUKTE
(MERM)
.
25
1.4.2
DEATH
ASSOCIATED
PROTEIN
3
(DAP-3)
.
27
1.5
A
UFGABENSTELLUNG
UND
Z
IELE
DER
VORLIEGENDEN
A
RBEIT
.
28
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
29
2.1
C
HEMIKALIEN
,
M
EDIENZUSAETZE
UND
A
NTIKOERPER
.
29
2.1.1
CHEMIKALIEN
UND
MEDIENZUSAETZE
.
29
2.1.2
VERWENDETE
ANTIBIOTIKA
.
30
2.1.3
VERWENDETE
ANTIKOERPER
.
30
2.2
B
IOLOGISCHES
M
ATERIAL
.
'.
.
31
2.3
S
PEZIELLE
P
UFFER
.
31
2
4
M
ETHODEN
.
31
2.4.1
DNA-SEQUENZANALYSE
.
31
2.4.2
PROTEIN-SEQUENZANALYSE
.
32
2.4.3
RNA
ISOLIERUNG
AUS
GEWEBE
UND
ZELLKULTURMATENAL
.
32
2.4.4
DIE
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
(PCR)
.
34
2.4.5
NORTHEM-BLOT
.
35
2.4.6
KULTIVIERUNG
UND
LAGERUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
UND
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
37
2.4.7
PLASMID-KONSTRUKTION
.
38
2.4.8
SAEUGERZELLKULTIVIERUNG
.41
2.4.9
STANDARD-HEFEKULTUR
.42
2.4.10
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
.
43
2.4.11
PROTEINSOLUBIHSIERUNG
.
43
2.4.12
PROTEINBESTIMMUNG
.
43
2.4.13
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
44
2.4.14
WESTERN
BLOT
.
45
2.4.15
APOPTOSE
INDUKTIONSMETHODEN
.
46
2.4.16
APOPTOSE
NACHWEIS-ASSAYS
.
47
2.4.17
ZELLORGANELL
FAERBUNG
.
48
2.4.18
MITOCHONDNEN-ISOLIERUNG
AUS
RATTEN
UND
MAEUSELEBER
.
49
2.4.19
ZELLFRAKTIONIERUNG
VON
ZELLKULTURMATENAL
.
51
2.4.20
DIGITONMBEHANDLUNG
ISOLIERTER
MITOCHONDNEN
.
51
2.4.21
ALKALISCHE
PROTEINFRAKTIONIERUNG
.
52
2.4.22
TCA-FAELLUNG
.
52
3
ERGEBNISSE
.
53
3.1
M
DAP-3
S
EQUENZANALYSE
.53
INHALTSVERZEICHNIS
2
3.1.1
NORTHERN
BLOT
ZUR
BESTIMMUNG
DER
LAENGE
DERMDAP-3
CDNA
.
53
3.1.2
SEQUENZANALYSE
DER
MDAP-3
CDNA
.
54
3.1.3
ANALYSE
DER
PROTEINSEQUENZ
VON
MDAP-3
.
56
3.2
HOMOLOGIE
VON
MDAP-3
ZU
ANDEREN
GENEN.
61
3.2.1
HDAP-3
(DEATH
ASSOCIATED
PROTEIN
3)
.
62
3.2.2
LONIZMG
RADIATION
RESISTANCE
CONFENNG
GENE
(IRRCG)
.
63
3.2.3
DROSOPHILA
MELANOGASTER
CG3633
GEN
PRODUKT
.
63
3.2.4
C.
ELEGANS
CECL4A
4.2
GEN
PRODUKT
.
63
3.2.5
HYPOTHETISCHES
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
PROTEIN
YGL129C
.
64
3.2.6
ZUSAMMENFASSUNG
DER
HOMOLOGIE
VON
MDAP-3
ZU
ANDEREN
GENEN
.
64
3
3
M
DAP-3
M
RNA
V
ERTEILUNG
.
66
3.3.1
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
ZUR
ORGANVERTEILUNG
DER
MDAP-3
MRNA
.
66
3.3.2
IN
SITU-HYBNDISIERUNG
.
67
3
4
ETABLIERUNG
UND
EVALUIERUNG
VERSCHIEDENER
APOPTOSE
NACHWEISMETHODEN
.
67
3.4.1
BESTIMMUNG
DES
DNA-GEHALTES
MIT
PROPIDIUMIODID
(PI)
.
68
3.4.2
ANNEXM-V-FLUOS-FAERBUNG
.
69
3.4.3
DNA-FRAGMENTIERUNG
(DNA-LEITER)
.
7
.
70
3.5
ETABLIERUNG
DER
APOPTOSEINDUKTION
IN
MMC
UND
MTC
.
71
3.5.1
STIMULATION
VON
MMC
MIT
IFN-Y,
TNF-A,
ODER
FAS-AK.
.72
3.5.2
FAS-EXPRESSION
DURCH
IFN-YUND
TNF-A
STIMULATION
VON
MMC
UND
MFC
.73
3.5.3
APOPTOSEINDUKTION
M
MMC
UND
MFC
DURCH
IFN-Y,
TNF-A
UND
FAS-AK
STIMULATION
.
74
3.6
ANALYSE
DER
MDAP-3
EXPRESSION
IN
APOPTOTISCHEN
ZELLEN
.
75
3.6.1
MDAP-3
MRNA-EXPRESSION
NACH
APOPTOSESTIMULATION
.
76
3.6.2
MDAP-3
PROTEIN-EXPRESSION
NACH
APOPTOSESTIMULATION
.
77
3.7
A
NALYSE
DER
MDA
P-3
FUNKTION
DURCH
TRANSIENTE
UE
BEREXPRESSION
.
79
3.7.1
EXPRESSION
EINES
MDAP-3/EGFP-FUSIONSPROTEINES
.
80
3.7.2
APOPLOSEMDUKTION
M
MMCS
DURCH
TRANSIENTE
UEBEREXPRESSION
DES
MDAP-3/EGFP
FUSIONSPROTEMES
.
81
3.7.3
EM
FUNKTIONELLER
P-LOOP
IST
ESSENTIELL
FUER
DIE
APOPTOSEINDUKTION DURCH
MDAP-3
.
82
3.7.4
MDAP-3
UBEREXPRESSION
BEWIRKT
DIE
FREISETZUNG
VON
CYTOCHROM
C
.
83
3.8
L
OKALISATION
VON
M
DAP-3
84
3.8.1
COMPUTER
GESTUETZTE
VORHERSAGE
DER
INTRAZELLULAEREN
DAP-3
LOKALISATION
.
84
3.8.2
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
DES
MDAP-3/EGFP-FUSIONSPROTEINES
.
85
3.8.3
MITO-TRACKER-RED
CMXROSYY
FAERBUNG
.
87
3.8.4
LYSO-TRACKER-REDYY
FAERBUNG
.
89
3.8.5
KONFOKALE-LASER-SCANMNG-MIKROSKOPIE
.
90
3.8.6
MITOCHONDRIALE
LOKALISATION
DES
ENDOGENEN
MDAP-3
DURCH
ZELLFRAKTIONIERUNG
.
92
3.8.7
DAP-3
BLEIBT
BEI
APOPTOSE
MITOCHONDRIAL
LOKALISIERT
.
97
3.8.8
EINE
KONSERVIERTE
N-TERMMALE
SEQUENZ
IST
VERANTWORTLICH
FUER
DIE
MITOCHONDRIALE
LOKALISATION
VON
MDAP-399
3.9
CHARAKTERISIERUNG
DES
HEFE
MDAP-3
HOMOLOGS
.
107
3.9.1
YGL129C
NULLMUTATION
FUHRT
ZU
MTDNA-VERLUST
.
108
3.9.2
MDAP-3
TRANSFEKTION
RETTET
DEN MTDNA-VERLUST
DERYDAP-3
NULLMUTANTEN
.
109
4
DISKUSSION
.
111
4.1
E
TABLIERUNG
VON
A
POPTOSE
-
I
NDUKTION
UND
-N
ACHWEIS
.
111
4.1.1
IFN-Y
INDUZIERTE
APOPTOSE
IN
MURINEN
ZELHMEN
.
111
4.1.2
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
APOPTOSENACHWEISVERFAHREN
.
112
4.2
M
DAP-3
E
XPRESSION
WAEHREND
DER
A
POPTOSE
.
113
4.2.1
MDAP-3
MRNA
VERAENDERUNG
WAEHREND
IFN-Y
UND
TNF-A
INDUZIERTER
APOPTOSE
.
113
4.2.2
MDAP-3
PROTEIN
VERAENDERUNG
WAEHREND
IFN-Y,
TNF-A
UND
FAS-ANTIKOERPER
INDUZIERTER
APOPTOSE
114
4.3
UEBEREXPRESSION
VON
MDAP-3
BESTAETIGT
DIE
PRO-APOPTOTISCHE
FUNKTION
VON
MDAP-3
.
115
4.4
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
VON
MDAP-3
.
117
4.4.1
DREI
UNTERSCHIEDLICHE
EXPERIMENTE
BESTAETIGEN
DIE
MITOCHONDRIALE
LOKALISATION
.
117
4.4.2
DAS
VOLLAENGE
MDAP-3
PROTEIN
IST
FUER
EINE
PROTEINMTERAKION
NOTWENDIG
.
117
4.5
IDENTIFIZIERUNG
EINER
ZWEITEN
PHYLOGENETISCH
AELTEREN
FUNKTION
DER
DAP-3
PROTEINE
.
118
4.6
M
OEGLICHE
E
INORDNUNG
DER
DAP-3
F
UNKTION
IN
DIE
A
POPTOSE
.
120
4.6.1
REGULATION
DER
DUALEN
DAP-3
FUNKTION
.
120
4.6.2
INTERAGIERT
DAP-3
MIT
DEM
GLUCOCORTICOID-REZEPTOR
7
.
122
4.6.3
DAP-3
IST
EM
MITOCHONDRIALES
NBOSOMALES
PROTEIN
.
123
INHALTSVERZEICHNIS
_
AE
4.7
AUSBLICK
.
126
5
ANHANG
_
128
5.1
S
EQUENZEN
DER
VERWENDETEN
PCR-P
JUMER
.
128
5.1.1
SITE-DIRECTED
MUTAGENESIS
PNMER.
.
128
5.1.2
MDAP-3/EGFP-FUSIONSPROTEIN
PRIMER
.
128
5.1.3
MDAP-3
HEFEEXPRESSION
.
128
5.2
S
EQUENZEN
DER
VERWENDETEN
S
EQUENZIER
-P
RIMER
.
128
5.2.1
SENSE
PNMER
.
128
5.2.2
ANTISENSE
PRIMER.
.
129
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
130
LEBENSLAUF
.
151
DANKSAGUNG
_
153 |
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