Kommunikation zwischen Mastzellen und enterischen Neuronen: Ein Modell der Nahrungsmittelallergie bei der Ratte
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler Verlag
2015
|
| Ausgabe: | 1. Auflage |
| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | x, 175 Seiten Illustrationen, Diagramme |
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1.
EINLEITUNG.............................................................................................................................1
1.1. BEDEUTUNG DER
NAHRUNGSMITTELALLERGIE........................................................................................
1
1.2. GALT UND ORALE
TOLERANZ............................................................................................................3
1.3. MECHANISMUS DER
NAHRUNGSMITTELALLERGIE...................................................................................8
1.4.
MASTZELLEN...................................................................................................................................
12
1.5. DAS ENTERISCHE
NERVENSYSTEM....................................................................................................
15
1.6. INTERAKTIONEN ZWISCHEN ENTERISCHEM NERVENSYSTEM UND IMMUNSYSTEM
.................................
19
1.7.
HISTAMINREZEPTOREN....................................................................................................................
22
1.8.
FRAGESTELLUNG..............................................................................................................................
23
2. MATERIAL UND
METHODEN...................................................................................................24
2.1.
TIERE............................................................................................................................................
24
2.2.
ZELLLINIE.......................................................................................................................................24
2.3.
LOESUNGEN.....................................................................................................................................24
2.3.1. LOESUNGEN FUER DIE PRAEPARATION SOWIE FUER DIE FUNKTIONELLEN
EXPERIMENTE
......................
24
2.3.1.1. BICARBONATGEPUFFERTE
PARSONS-LOESUNG..............................................................24
2.3.1.2.
TYRODE.................................................................................................................25
2.3.1.3. CA2+-FREIE
TYRODE................................................................................................25
2.3.1.4. NA+-FREIE
TYRODE................................................................................................
25
2.3.1.5. FAERBELOESUNG MIT FURA-2-AM UND PLURONIC ACID
..............................................
25
2.3.2. LOESUNGEN FUER DIE
ZELLKULTUREN........................................................................................
26
2.3.2.1.
PRAEPARATIONSLOESUNG.............................................................................................26
2.3.2.2. ENZYMATISCHE DIGESTIONSLOESUNG
.......................................................................
26
2.3.2.3. NEUROBASAL-A-MEDIUM ZUR KULTIVIERUNG DER PRIMAEREN SUBMUKOSA
-KULTUR..26
2.3.2.4. MEMA-MEDIUM ZUR KULTIVIERUNG DER RBL-2H3-ZELLEN UND DER
CO-KULTUR. 26
2.3.2.5. EINFRIERMEDIUM DER
RBL-2H3-ZELLEN..............................................................
26
2.3.3. LOESUNGEN FUER DIE IMMUNZYTOCHEMISCHEN MARKIERUNGEN
..............................................
27
2.3.3.1. PHOSPHATPUFFER
(PB)..........................................................................................
27
2.3.3.2. PHOSPHATPUFFERSALZLOESUNG
(PBS-LOESUNG).........................................................27
2.3.3.3. TRITON-X-100-HALTIGE PBS-LOESUNG
...................................................................
27
2.3.3.4.
FIXIERUNGSLOESUNG................................................................................................
27
2.3.3.5.
BLOCKIERUNGSLOESUNG............................................................................................28
2.3.3.6.
PRIMAERANTIKOERPERLOESUNGEN..................................................................................28
2.3.3.7. SEKUNDAERANTIKOERPERLOESUNGEN
.............................................................................
26
2.3.3.8. LOESUNG ZUR
KERNFAERBUNG....................................................................................
28
2.4.
WIRKSTOFFE....................................................................................................................................
28
2.5.
PRAEPARATION...................................................................................................................................
29
2.5.1. PRAEPARATION DER SUBMUKOSA-MUKOSA-PRAEPARATE FUER DIE
USSINGKAMMER-MESSUNGEN...29
2.5.2. PRAEPARATION DER JEJUNUMSEGMENTE FUER DIE USSINGKAMMER-MESSUNGEN
........................
30
2.5.3. PRAEPARATION DER SUBMUKOSA FUER CA2+-IMAGING-EXPERIMENTE UND
MIKROELEKTRODEN-
MESSUNGEN........................................................................................................................30
2.6.
ZELLKULTUR.....................................................................................................................................
32
2.6.1. PRIMAERE ZELLKULTUR DER SUBMUKOSA AUS DEM KOLON DER RATTE
.......................................
32
2.6.1.1. KULTURBEDINGUNGEN DER PRIMAEREN SUBMUKOESEN ZELLKULTUR
................................
32
2.6.1.2. HERSTELLUNG DER PRIMAEREN SUBMUKOESEN
ZELLKULTUR............................................ 32
2.6.2. ZELLLINIE
RBL-2H3...........................................................................................................
33
2.6.2.1.
KULTURBEDINGUNGEN.............................................................................................33
2.6.2.2. AUFTAUEN DER
ZELLEN............................................................................................
34
2.6.2.3. PASSAGIEREN DER ZELLEN
.......................................................................................
34
2.6.2.4. EINFRIEREN DER
ZELLEN..........................................................................................
35
2.6.3. CO-KULTUR AUS KULTIVIERTEN ZELLEN DER SUBMUKOSA DER RATTE UND
RBL-2H3-ZELLEN....35
2.6.3.1. KULTURBEDINGUNGEN DER CO-KULTUR
....................................................................
35
2.6.3.2. HERSTELLUNG DER
CO-KULTUR.................................................................................
36
2.7. BESCHICHTUNG DER GLASPLAETTCHEN SOWIE DER
ZELLKULTURSCHALEN..................................................36
2.8. PROTOKOLL ZUR IMMUNISIERUNG DER RATTEN MIT OVALBUMIN
.........................................................
37
2.9.
CA2+-IMAGING................................................................................................................
38
2.9.1. THEORIE DES
CA2+-IMAGINGS...............................................................................................38
2.9.2. FLUORESZENZFARBSTOFF FURA-2
............................................................................................
40
2.9.3.
MESSSTAND.........................................................................................................................
42
2.9.4. MESSKAMMER UND
PERFUSIONSSYSTEM...............................................................................
43
2.9.5.
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG.....................................................................................................
43
2.9.6. DATENERFASSUNG UND
DATENAUSWERTUNG............................................................................45
2.10. INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ.....................................................................................................46
2.10.1. GRUNDLAGEN DER INDIREKTEN
IMMUNFLUORESZENZ.........................................................
46
IV
2.10.2. VERWENDETE
ANTIKOERPER..................................................................................................48
2.10.3.
NEGATIVKONTROLLEN..........................................................................................................49
2.10.4. FIXIERUNG DER
ZELLKULTUREN............................................................................................
50
2.10.5. HERSTELLUNG DER IMMUNZYTOCHEMISCHEN DOPPELMARKIERUNGEN
...................................
51
2.10.6.
MIKROSKOPIE...................................................................................................................
53
2.11. POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)............................................................................................
53
2.11.1. PRINZIP DER
PCR.............................................................................................................
53
2.11.2. ISOLATION DER
MRNA......................................................................................................
56
2.11.3. REVERSE TRANSKRIPTION (RT) ZUR SYNTHESE DER
CDNA...................................................56
2.11.4. PCR ZUR AMPLIFIZIERUNG DER
CDNA..............................................................................58
2.11.5.
GELELEKTROPHORESE...........................................................F.............................................60
2.12. MIKROELEKTRODEN-ABLEITUNG DES
MEMBRANPOTENTIALS..............................................................61
2.12.1. DIE ERMITTLUNG DES MEMBRANPOTENTIALS MITTELS
MIKROELEKTRODE.................................61
2.12.2.
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG...................................................................................................61
2.13.
USSINGKAMMER-MESSUNGEN......................................................................................................63
2.13.1. THEORIE DER
USSINGKAMMER-MESSUNGEN.......................................................................63
2.13.2.
MESSKAMMER.................................................................................................................
65
2.13.3. VERSUCHSDURCHFUEHRUNG UND
DATENERFASSUNG.................................................................66
2.14. MESSUNGEN DER PARAZELLULAEREN PERMEABILITAET
..........................................................................
67
2.15.
STATISTIK.....................................................................................................................................
69
3.
ERGEBNISSE.......................................................................................................................70
3.1. UNTERSUCHUNG DER HISTAMINWIRKUNG AUF NEURONE DES PLEXUS SUBMUCOSUS
AUS DEM KOLON
DER
RATTE......................................................................................................................................
71
3.1.1. CHARAKTERISIERUNG DER WIRKUNG VON HISTAMIN AUF NEURONE DER
PRIMAEREN SUBMUKOE
SEN
ZELLKULTUR..................................................................................................................
71
3.1.1.1. KONZENTRATIONSABHAENGIGE HISTAMINWIRKUNG VON KULTIVIERTEN
SUBMUKOESEN
NEURONEN...........................................................................................................
72
3.1.1.2. DER EINFLUSS VON TETRODOTOXIN AUF DIE
HISTAMINWIRKUNG................................76
3.1.1.3. IDENTIFIZIERUNG DER CALCIUMQUELLE FUER DIE
HISTAMINWIRKUNG...........................76
3.1.1.4. DIE UNTERSUCHUNG DES PARADOXEN HISTAMINEFFEKTES IN GEGENWART
VON
CYCLOPIAZONSAEURE..............................................................................................
82
3.1.2. IDENTIFIZIERUNG DER BETEILIGTEN
HISTAMINREZEPTOREN.......................................................
86
3.1.2.1.
RT-PCR...............................................................................................................
86
3.1.2.2. IMMUNZYTOCHEMISCHE DOPPELMARKIERUNGEN
....................................................
88
3.1.2.3. FUNKTIONELLE IDENTIFIZIERUNG MITTELS AGONISTEN
................................................
90
3.1.2.4. FUNKTIONELLE IDENTIFIZIERUNG MITTELS ANTAGONISTEN
...........................................
92
3.1.3. DIE WIRKUNG VON HISTAMIN AUF NEURONE DES INTAKTEN PLEXUS
SUBMUCOSUS..............96
3.1.3.1. DIE REAKTION VON NEURONEN DES INTAKTEN PLEXUS SUBMUCOSUS AUF
HISTAMIN
IM
CA2+-IMAGING.................................................................................................
96
3.1.3.2. DIE AENDERUNG DES MEMBRANPOTENTIALS DURCH HISTAMIN IN NEURONEN
DES
INTAKTEN PLEXUS
SUBMUCOSUS..............................................................................
96
3.2. DIE EXPRESSION DES ENZYMS HISTIDINDECARBOXYLASE IN NEURONEN DES
PLEXUS SUBMUCOSUS.. .98
3.2.1. IMMUNZYTOCHEMISCHE
DOPPELMARKIERUNGEN..................................................................
98
3.2.2.
RT-PCR.............................................................................................................................
99
3.3. DIE KOMMUNIKATION ZWISCHEN KULTIVIERTEN SUBMUKOESEN NEURONEN UND
RBL-2H3-ZELLEN
AM MODELL DER
CO-KULTUR..........................................................................................................
101
3.3.1. DIE STIMULATION SUBMUKOESER NEURONE DURCH DEGRANULATION VON
RBL-2H3-ZELLEN.. 101
3.3.1.1. DER EFFEKT VON COMPOUND 48/80 AUF RBL-2H3-ZELLEN
................................
101
3.3.1.2. DER EFFEKT VON COMPOUND 46/80 AUF KULTIVIERTE SUBMUKOESE NEURONE
........
102
3.3.2. UNTERSUCHUNG BETEILIGTER
MASTZELLMEDIATOREN..............................................................
106
3.3.2.1. DIE BETEILIGUNG VON HISTAMIN
.........................................................................
107
3.3.2.2. DIE BETEILIGUNG VON EICOSANOIDEN
..................................................................
110
3.3.2.3. DIE BETEILIGUNG VON
MASTZELLPROTEASEN...........................................................111
3.3.3. UNTERSUCHUNG DER MOEGLICHEN AKTIVIERUNG VON RBL-2H3-ZELLEN DURCH
STIMULATION
SUBMUKOESER
NEURONE.....................................................................................................
113
3.4. UNTERSUCHUNG DER ANTIGENWIRKUNG AUF EPITHELIALEN TRANSPORT UND
PARAZELLULAERE
PERMEABILITAET AN SENSIBILISIERTEN
TIEREN....................................................................................115
3.4.1. ANTIGENINDUZIERTE VERAENDERUNGEN DES KURZSCHLUSSSTROMS UND DER
PARAZELLULAEREN
FLUXE AM K
OLON.............................................................................................................116
3.4.1.1. AENDERUNG DES
KURZSCHLUSSSTROMS....................................................................116
3.4.1.2. BETEILIGUNG VERSCHIEDENER
MASTZELLMEDIATOREN.............................................117
3.4.1.3. AENDERUNG DER PARAZELLULAEREN
PERMEABILITAET.....................................................120
3.4.2. ANTIGENINDUZIERTE VERAENDERUNGEN DES KURZSCHLUSSSTROMS UND DER
PARAZELLULAEREN
FLUXE AM
JEJUNUM..........................................................................................................
122
3.4.2.1. AENDERUNG DES
KURZSCHLUSSSTROMS....................................................................122
3.4.2.2. BETEILIGUNG VERSCHIEDENER
MASTZELLMEDIATOREN..............................................122
VI
3
.
4
.
23
.
AENDERUNG DER PARAZELLULAEREN
PERMEABILITAET......................................................125
4. D
ISKUSSION......................................................................................................................
128
4.1. DIE BEDEUTUNG DES ALLERGISCHEN MEDIATORS HISTAMIN UND SEINE WIRKUNG
AUF SUBMUKOESE
NEURONE.....................................................................................................................................
129
4.2. INTERAKTIONEN ZWISCHEN SUBMUKOESEN NEURONEN UND RBL-2H3-ZELLEN IN
DER CO-KULTUR....L39
4.3. UNTERSUCHUNG VON ISC UND PASSIVER PERMEABILITAET IM ALLERGIEMODELL
.....................................
149
4.4.
FAZIT...........................................................................................................................................155
5.
ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................................
158
6.
SUMMARY.........................................................................................................................
160
7.
LITERATURVERZEICHNIS......................................................................................................161
8. EIGENE
PUBLIKATIONEN...................................................................................................
173
9.
DANKSAGUNG....................................................................................................................174
10.
ERKLAERUNG.........................................................................................................................175
VII
|
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