Freisetzung rekombinanter Proteine aus Escherichia coli in die Fermentationslösung durch die Wirkung des endogenen Faktors Kil:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
1. EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG 1
1.1 COLICINE - EIN BEISPIEL FUER PROTEINEXKRETION BEI
E. COLI 3
1.2 ANFORDERUNGEN AN EIN SYSTEM ZUR KONTROLLIERTEN EXKRETION
REKOMBINANTER
PROTEINE IN DAS NAEHRMEDIUM 8
1.3 AUFGABENSTELLUNG 10
2. MATERIAL 12
2.1 ORGANISMEN 12
2.2 PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 12
2.3 CHEMIKALIEN, ENZYME UND KITS 13
2.4 HAEUFIG VERWENDETE PUFFERLOESUNGEN, NAEHRMEDIEN UND ANTIBIOTIKA 14
2.5 MATERIALIEN UND GERAETE 15
3. EXPERIMENTELLE METHODEN 16
3.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 16
3.1.1 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON
E. CO/Z-STAEMMEN 16
3.1.2 IODOMETRISCHE BESTIMMUNG DER SEGREGATIONSSTABILITAET VON PLASMIDEN
17
3.1.3 ZUGABE VON FREMDSUBSTANZEN ZU KULTURLOESUNGEN 17
3.1.4 INDUKTION UND FREISETZUNG REKOMBINANTER PROTEINE 17
3.2 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 18
3.2.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 18
3.2.2 KLONIERUNG VON PLASMID-DNA 18
3.2.3 TRANSFORMATION VON
E. COLI-ZELLEN UND SELEKTION POSITIVER TRANSFORMANTEN 20
3.2.4 SICHTUNG POSITIVER TRANSFORMANTEN DURCH A-KOMPLEMENTATION 20
3.2.5 AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS NATIVER AGAROSE- UND
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 21
3.2.6 DNA-AMPLIFIKATION UND GENSYNTHESE MITTELS PCR 21
3.2.7 3 '-ENDMARKIERUNG VON DNA MIT DIGOXIGENIN 23
3.2.8 NACHWEIS FREIER PLASMID-DNA 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
3.2.9 DNA-SEQUENZIERUNG NACH SAENGER 24
3.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 25
3.3.1 PHYSIKALISCHER GESAMTZELLAUFSCHLUSS DURCH EINWIRKUNG VON
ULTRASCHALL
UND SELEKTIVER PERIPLASMA-AUFSCHLUSS 25
3.3.2 KONZENTRIERUNG VON PROTEINLOESUNGEN 26
3.3.3 PROTEINQUANTIFIZIERUNG 26
3.3.4 LEBENDANFARBUNG VON
E. CO/I-ZELLEN MIT ACRIDINORANGE 26
3.3.5 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER CHLORAMPHENICOLACETYLTRANSFERASE 27
3.3.6 QUANTITATIVE AKTIVITAETSBESTIMMUNG VON SS-LACTAMASE 28
3.3.7 FUNKTIONELLER SCF
V425-ANTIKOERPERFRAGMENT-ELISA (FF-ELISA) 28
3.3.8 AUFTRENNUNG VON PROTEINEN DURCH SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
29
3.3.9 ELEKTROBLOTTING 30
3.3.10 IMMUNOLOGISCHER PROTEINNACHWEIS VON SCF
V425-ANTIKOERPERFRAGMENTEN 31
3.3.11 DENSITOMETRISCHE QUANTIFIZIERUNG VON SCF
V425-ANTIKOERPERFRAGMENTEN 32
3.3.12 DETEKTION DIGOXIGENIERTER DNA 32
3.3.13 UNTERSUCHUNG VON DNA/PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN 33
3.3.14 VERGLEICH DER ELEKTROPHORETISCHEN MOBILITAET VON DNA MIT
DNA/PROTEIN-
KOMPLEXEN IN NATIVEN POLYACRYLAMIDGELEN 34
3.3.15 NACHWEIS DES KIL-PEPTIDS IN DER AEUSSEREN MEMBRAN VON
E. COLI DURCH
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG UND IMMUNODETEKTION 34
4. ERGEBNISSE 36
4.1 ENTWICKLUNG VON PROMOTORTESTVEKTOREN FUER
MCBAP UND KONSTRUKTION DES
EXPRESSIONSVEKTORS PHB425EXE22 36
4.1.1 DARSTELLUNG DER EXPRESSIONSEINHEIT FUER DAS REPORTERGEN
KILWLACZ 36
4.1.2 DARSTELLUNG DER PROMOTORTESTPLASMIDE ZUR AKTIVITAETSBESTIMMUNG
MITTELS CAF-REPORTERGEN 37
4.1.3 KLONIERUNG DES PROMOTORS
MCBP3 37
4.1.4 DARSTELLUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS PHB425EXE22 ZUR AUSSCHLEUSUNG
VON FUNKTIONELLEN SCF
V425-ANTIKOERPERFRAGMENTEN IN DAS NAEHRMEDIUM 40
4.2 ABHAENGIGKEIT DER AKTIVITAET DES MICROCIN-PROMOTORS
MCBAP VON MULTIPLEN
EXOGENEN FAKTOREN 41
4.2.1 NORMIERUNG DER PLASMIDKOPIEZAHL DURCH BESTIMMUNG DES KONSTITUTIV
EXPRIMIERTEN REFERENZMOLEKUELS SS-LACTAMASE 42
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.2.2 VERGLEICH DER EXPRESSIONSLEISTUNGEN DER MICROCIN-PROMOTORVARIANTEN
42
4.2.3 EINFLUSS DER KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN AUF DIE AKTIVITAET VON
MCBAP 44
A) EINFLUSS VON NAEHRSTOFFLIMITATIONEN 44
B) EINFLUSS PARTIELLER AMINOSAEURELIMITATION 45
C) EINFLUSS ERHOEHTER MEDIUMOSMOLARITAET 45
D) EINFLUSS OXIDIERENDER SUBSTANZEN 46
E) EINFLUSS VON TEMPERATURERHOEHUNG UND PH-WERTAENDERUNG 47
F) BEDEUTUNG DES SIGMAFAKTORS A 48
4.2.4 UNTERSUCHUNG DER REGULATORISCHEN FUNKTION VON
MCBP3 49
4.3 UNTERSUCHUNG DES PROMOTORS
MCBAP AUF POTENTIELLE PROTEINBINDUNGSSTELLEN 51
4.4 EINFLUSS DER AI7-EXPRESSION AUF DIE FREISETZUNG VON PROTEINEN AUS
E. COLI-ZELLEN
IN DIE NAEHRLOESUNG 52
4.4.1 VERGLEICH DER PERIPLASMATISCHEN PROTEINMUSTER NACH SDS-PAGE 53
4.4.2 NACHWEIS EXKRETIERTER PROTEINE IN DER NAEHRLOESUNG 54
4.4.3 BESTIMMUNG DER ZELLVITALITAET VON
E. COLI DURCH LEBENDANFARBUNG
MIT ACRIDINORANGE 55
4.4.4 ERMITTLUNG DER LYSERATE DURCH NACHWEIS FREIER PDNA IN DER
NAEHRLOESUNG 55
4.5 FREISETZUNG PERIPLASMATISCHER SCF
V425-ANIKOERPERFRAGMENTE IN DAS NAEHRMEDIUM
DURCH DIE WIRKUNG DES KOSYNTHETISIERTEN MEMBRANAKTIVEN LIPOPROTEINS KIL
56
4.5.1 NACHWEIS FUNKTIONELLER SCF
V425-ANTIKOERPERFRAGMENTE IM FF-ELISA 56
4.5.2 VERGLEICH DER ANTEILE NICHT VERKUERZTER UND VON PROZESSIERTEN SCF
V425-
ANTIKOERPERFRAGMENTEN DURCH NACHWEIS IM WESTEM-BLOT 57
4.6 EXPRESSION UND AUSSCHLEUSUNG DES CYTOPLASMATISCHEN PROTEINS CAT IN
DAS
PERIPLASMA VON
E. COLI UND IN DIE NAEHRLOESUNG 60
4.6.1 BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN CAT-MENGE 60
4.6.2 NACHWEIS VON CAT IN DER PERIPLASMATISCHEN PROTEINFRAKTION UND
IN DER NAEHRLOESUNG 61
4.7 EINFLUSS VON TRITON X-100 AUF DIE EXKRETION VON CAT UND VON SCF
V425-
ANTIKOERPERFRAGMENTEN IN DIE NAEHRLOESUNG 62
4.8 ISOLIERUNG DES KIL-PEPTIDS AUS
E. COLI-ZELLEN UND NACHWEIS DURCH ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG UND IMMUNOBIOTTING 64
4.9 TABELLARISCHE ZUSAMMENFASSUNG DER MESSWERTE 65
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5. DISKUSSION 70
CHARAKTERISIERUNG DES PROMOTORS
MCBAP UND SEINER INDUKTIONSBEDINGUNGEN 70
DER EINFLUSS DER RNAP-UNTEREINHEIT ER
32 AUF DIE TRANSKRIPTION VON MCBAP 75
ENTWICKLUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS ZUR ENDOGENEN
MEMBRANPERMEABILISIERUNG
IN
ESCHERICHIA COLI 80
FREISETZUNG REKOMBINANTER SCF
V425-ANTIKOERPERFFAGMENTE IN DAS NAEHRMEDIUM - .
EXKRETION ODER LYSE ? 81
DIE EXKRETION VON CAT ALS CYTOPLASMATISCHES REFERENZPROTEIN 85
EINFLUSS DER ^//-EXPRESSION AUF DIE SYNTHETISIERTE MENGE REKOMBINANTER
SCF
V425-
ANTIKOERPERFRAGMENTE 85
UNTERSUCHUNG DER KOOPERATIVEN WIRKUNG VON TRITON X-100 UND DES
KIL-PEPTIDS AUF
DIE FREISETZUNGSRATE 86
AUSBLICK 86
6. ZUSAMMENFASSUNG 88
7. LITERATURVERZEICHNIS 90 |
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