Interaktionen von humanen Immuneffektorzellpopulationen mit dem humanpathogenen Pilz Aspergillus fumigatus, sowie der Einfluss von40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf deren Funktionen:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 SUMMARY 3
3 EINLEITUNG 5
3.1 ASPERGILLUS FUMIGATUS 5
3.1.1 LEBENSZYKLUS 5
3.1.2 PATHOPHYSIOLOGIE VON AS/)ERGZ7/W.V-INFEKTIONEN 7
3.2 DAS IMMUNSYSTEM IN BEZUG A U F ASPERGILLUS FUMIGATUS 8
3.2.1 NEUTROPHILE GRANULOZYTEN 8
3.2.2 DENDRITISCHE ZELLEN 9
3.2.3 REZEPTOREN ZUR ERKENNUNG VON ASPERGILLUS FUMIGATUS 11
3.2.4 ZYTOKINE 14
3.3 MODELLSYSTEME 16
3.3.1 IN VITRO GENERIERTE DENDRITISCHE ZELLEN 16
3.3.2 MODELL DER FRUEHEN INVASIVEN ASPERGILLOSE IN DER LUNGE 17
3.4 IMMUNSUPPRESSIVA 18
3.4.1 UEBERBLICK UEBER GAENGIGE IMMUNSUPPRESSIVA 18
3.4.2 40-0-[2-HYDROXYETHYL]RAPAMYCIN (RAD) 20
3.5 ZIELE DER ARBEIT _ _ 22
4 MATERIALIEN 23
4.1 ZELLEN UND STAEMME 2 3
4.2 GEBRAUCHSFERTIGE SUBSTANZEN 23
4.3 OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDSEQUENZEN 24
4.3.1 PRIMERSEQUENZEN 24
4.3.2 SONDENSEQUENZEN 25
4.3.3 SIRNAS 26
4.4 SUBSTANZEN UND LOESUNGEN 26
4.4.1 REAGENZIEN FUER ZELLKULTUR 27
4.4.2 SUBSTANZEN FUER MICROARRAY-ANALYSEN 27
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
- I I -
4.4.3 SUBSTANZEN FUER GELELEKTROPOHORESE 28
4.4.4 FARBSTOFFE UND FACS-ANTIKOERPER 28
4.4.5 ANTIKOERPER, SUBSTANZEN UND PUFFER FUER ELISA 29
4.4.6 AGAR-PLATTEN 30
4.5 GERAETE 30
4.6 VERBRAUCHSMATERIALIEN 31
4.7 SOFTWARE 32
5 METHODEN 33
5.1 ARBEITEN MIT ASPERGILLUS FUMIGATUS 33
5.2 WACHSTUMSEXPERIMENT 33
5.3 PRIMAERZELLEN 34
5.3.1 ISOLATION VON PBMCS 34
5.3.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN PRIMAERER ZELLEN 35
5.3.3 ZELLZAHLBESTIMMUNG IN DER NEUBAUER-ZAEHLKAMMER 35
5.3.4 ISOLATION VON CD14+-ZELLEN 36
5.3.5 IN VITRO GENERIERUNG UNREIFER DENDRITISCHER ZELLEN 37
5.3.6 GENERIERUNG VON HEPARIN-SERUM MODCS 38
5.3.7 ISOLATION VON MYELOIDEN DENDRITISCHEN ZELLEN 38
5.3.8 ISOLATION VON CD8+ T-LYMPHOZYTEN 39
5.3.9 ISOLATION VON NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN 40
5.3.10 ELEKTROPORATION MIT SIRNA 40
5.3.11 DURCHFLUSSZYTOMETER 41
5.4 ZELLLINIEN 42
5.4.1 HPAEC 42
5.4.2 A-549 43
5.4.3 EINFRIEREN VON ZELLLINIEN 44
5.5 ALVEOLAREPITHELMODELL 44
5.6 MICROARRAY-ANALYSE 45
5.6.1 AMPLIFIKATION DER RNA 45
5.6.2 LABELLING UND CDNA SYNTHESE 46
5.6.3 HYBRIDISIERUNG UND ANALYSE 46
5.7 GENEXPRESSIONS- UND PROTEINSTUDIEN 4 7
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
- I I I -
5.7.1 INFEKTION DER MODCS ZUR ANALYSE DER ZYTOKINPRODUKTION 47
5.7.2 DNA ISOLIERUNG UND REINIGUNG 47
5.7.3 RNA ISOLIERUNG UND REINIGUNG 47
5.7.4 REVERSE TRANSKRIPTION 48
5.7.5 REALTIME POLYMERASEKETTENREAKTION 49
5.7.5.1 DURCHFUHRUNG IM LIGHTCYCLER 49
5.7.5.2 DURCHFUEHRUNG IM STEPONEPLUS 51
5.7.5.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 52
5.7.6 ELISA _ _ _ _ _ 52
5.7.6.1 DURCHFUHRUNG NACH BIOSOURCE 52
5.7.6.2 HOME-MADE ELISA-ASSAYS _ _ 53
5.8 KONFRONTATIONSUNTERSUCHUNGEN 54
5.8.1 ANALYSE DER OBERFLAECHENMARKER _ _ 54
5.8.2 T-ZELL-PROLIFERATIONS ASSAY 54
5.8.3 OXIDATIVER BURST 55
5.8.4 PHAGOZYTOSE-ASSAY 56
5.8.4.1 DURCHFUHRUNG MIT DEXTRAN-BEADS 56
5.8.4.2 DURCHFUEHRUNG MIT ASPERGILLUS FUMIGATUS KONIDIEN 56
5.8.5 PLATTENBASIERTER ABTOETUNGSVERSUCH 56
5.9 STATISTIK 57
6 ERGEBNISSE 58
6.1 KONTROLLE DER REINHEIT DER ISOLIERTEN, PRIMAEREN ZELLEN 58
6.2 EINFLUSS VON R A D ALS BEISPIEL EINES IMMUNSUPPRESSIVUMS A U F DAS
PILZWACHSTUM _ _ 61
6.3 EINFLUSS VON R A D A U F NEUTROPHILE GRANULOZYTEN 62
6.4 EINFLUSS VON R A D A U F MODCS 64
6.4.1 AUSDIFFERENZIERUNG DER MODCS 64
6.4.2 EXPRESSION VON DEN REZEPTOREN TLR2, TLR4 UND DECTIN-1 AUF MODCS 66
6.4.3 AUSREIFEN DER MODCS NACH KONFRONTATION MIT ASPERGILLUS FUMIGATUS
ODER LPS _68
6.4.4 AUSSCHUETTUNG VON ZYTOKINEN _ _ _ 69
6.4.5 PHAGOZYTOSE VON DEXTRAN-BEADS UND ASPERGILLUS FUMIGATUS KONIDIEN
72
6.4.6 KILLING VON ASPERGILLUS FUMIGATUS 73
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS - I V -
6.4.7 CD8+ T-ZELL PROLIFERATION 75
6.5 INTERAKTION ZWISCHEN DENDRITISCHEN ZELLEN UND ASPERGILLUS FUMIGATUS
IM
ALVEOLAREPITHELMODELL 76
6.5.1 MICROARRAY-ANALYSE DER DENDRITISCHEN ZELLEN ZUSAMMEN MIT
A-549-ZELLEN 76
6.5.2 EXPRESSIONSANALYSE ZUR BESTAETIGUNG DER MICROARRAY-ANALYSE 82
6.6 ANALYSEN DES CXCLIO-GENS 83
6.6.1 ANALYSE DREIER SNPS IM CXCLIO-GEN 83
6.6.2 UNTERDRUECKUNG DES CXCLIO-GENS MITTELS SIRNA 85
6.6.3 EFFEKTE DES CXCLIO-KNOCKDOWNS AUF DIE INFLAMMATORISCHE
IMMUNANTWORT UND
REIFUNG DER MODCS 85
7 DISKUSSION 88
7.1 R A D 88
7.1.1 EINFLUSS DES ANTIMYKOTIKUMS RAD IN GERINGER KONZENTRATION AUF DAS
PILZWACHSTUM 89
7.1.2 INHIBITION DES OXIDATIVEN BURSTS NEUTROPHILER GRANULOZYTEN DURCH
RAD 89
7.1.3 DIE EXPRESSION VON DREI REZEPTOREN FUER ASPERGILLUS FUMIGATUS AUF
MODCS UNTER
RAD-BEHANDLUNG 90
7.1.4 DER EINFLUSS VON RAD AUF REIFUNG UND FUNKTION DENDRITISCHER ZELLEN
92
7.1.5 PHAGOZYTOSE UND SCHAEDIGUNG DES PILZES NACH BEHANDLUNG MIT RAD 94
7.1.6 EINFLUSS VON RAD AUF DIE PROLIFERATION VON CD8+-T-LYMPHOZYTEN 95
7.2 REGULATION DER EXPRESSION VON ZYTOKINEN DENDRITISCHER ZELLEN IM
ALVEOLAREPITHELMODELL NACH KONFRONTATION MIT ASPERGILLUS FUMIGATUS 96
7.3 IN VITRO UNTERSUCHUNG EINES RISIKOGENS FUER INVASIVE ASPERGILLOSE 99
7.3.1 SUPPRESSION DER EXPRESSION DES CXCLIO-GENS MITTELS SIRNA 99
7.3.2 EINFLUSS DES KNOCKDOWNS AUF ZYTOKINFREISETZUNG UND REIFUNG DER
MODCS NACH
KONFRONTATION MIT ASPERGILLUS FUMIGATUS 100
8 LITERATURVERZEICHNIS 101
9 ANHANG 116
9.1 ABKUERZUNGEN 116
9.2 LISTE DER MIRCROARRAY-OLIGONUKLEOTIDE 119
9.3 PUBLIKATIONSLISTE 126
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS ^
9.3.1 VEROEFFENTLICHUNGEN 126
9.3.2 KONGRESSBEITRAEGE 127
9.4 LEBENSLAUF 128
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