Untersuchungen zur Zytokin-induzierten Apoptose von Mesangiumzellen:
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Aachen
Shaker
2002
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| adam_text | 1.0 Inhaltsverzeichnis
Seite
1.0 Inhaltsverzeichnis 1
2.0 Zusammenfassung / Summary 5
3.0 Einleitung 9
3.1 Die Funktion der Niere 9
3.2 Die Anatomie der Niere 9
3.3 Das Nephron 11
3.4 Der Giomerulus 11
3.5 Die Mesangiumzelle 13
3.6 Physiologie der glomerulären Filtration 13
3.7 Pathophysiologie der Glomerulopathie 15
3.8 Glomerulonephritiden mit mesangialer Hyperzellularität 16
3.8.1 IgA Nephropathie 16
3.1.1 Akute Poststreptokokken assoziierte Glomerulonephritiden (APSGN) 18
3.1.2 Membranoproliferative Glomerulonephritis (Mesangiokapiläre GN) 19
3.1.3 Mesangioproliferative Glomerulonephritis (MsPGN) 20
3.2 Tiermodell der mesangial proliferativen Glomerulonephritis:
Das anti Thy 1 Modell 21
3.10 Apoptose (Programmierter Zelltod) 22
3.10.1 Kennzeichen von Apoptose und Nekrose 22
3.10.2 Regulation und Signaltransduktion der Apoptose 23
3.10.3 Die Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies bei der Apoptose 25
3.11 Tumor Nekrose Faktor a 26
3.12 lnterieukin 1a 27
3.13 Endothelin 28
3.14 Ziel der vorgelegten Dissertation 29
3.14.1 Neue Therapieansätze bei der MsPGN 29
3.14.2 Hypothesen 29
3.14.3 Aufgabenstellung 29
Seite
4.0 Material 31
4.1 Zellen 31
4.2 Kulturmedien und Zusätze 31
4.3 Puffer 31
4.4 Zytokine 32
4.5 Antikörper 32
4.6 Enzyme 33
4.7 Antibiotika 33
4.8 Chemikalien 33
4.9 Plastikwaren 35
4.10 Geräte 35
5.0 Methoden 37
5.1 Isolation von Rattenmesangiumzellen 37
5.2 Kultur der Mesangiumzellen 37
5.3 Immunzytochemie: APAAP Methode 38
5.4 Bestimmung der Zellproliferation durch [3H] Thymidin Einbau 38
5.5 Bestimmung der Zellproliferation durch MTT Assay 38
5.6 Quantifizierung der Zellzahl 39
5.7 Bestimmung der Apoptoserate mittels Immunfluoreszenzmikroskopie 39
5.8 Nachweis der Apoptose mittels der DNS Fragmentation 40
5.9 Qualitativer Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) 40
5.10 Quantitative Bestimmung der Lipidperoxidation 41
5.11 Western Blot 41
5.11.1 Probenaufarbeitung 41
5.11.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 42
5.11.3 Gelelektropherese 42
5.11.4 Elektro Transfer Blot 43
5.11.5 Immunfärbung 43
5.11.6 Densitometrische Auswertung 43
Seite
5.12 Reverse Polymerase Ketten Reaktion (rt PCR ) 44
5.12.1 Probenaufarbeitung 44
5.12.2 RNS Isolation 44
5.12.3 Reinigung der RNS 44
5.12.4 RNS Gelelekropherese 45
5.12.5 Reverse Transkription der der TNF RI RNS 45
5.12.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) der TNF RI cDNS 45
5.12.7 Klonierung des PCR Produkts 48
5.12.8 Minipräparation der Plasmid DNS (Vektor) 48
5.12.9 DNS Sequenzierung 49
5.13 PCR der humanen ET 2 transgenen DNS 49
5.13.1 DNS Isolation aus Mesangiumzellen 49
5.13.2 PCR 49
5.14 Statistik 51
6.0 Ergebnisse 51
6.1 Effekt von Tumor Nekrose Faktor o (TNF a) auf die Apoptoserate und
Zeilproliferation von Mesangiumzellen 51
6.1.1 TNF a induziert die DNS Fragmentation in Mesangiumzellen 51
6.1.2 TNF a induziert dosisabhängig die Apoptose von Mesangiumzellen 51
6.1.3 Kinetik der TNF a induzierten Apoptose von Mesangiumzellen 52
6.1.4 TNF a stimuliert nicht die Proliferation von Mesangiumzellen 53
6.2 Effekt von lnterleukin 1a (IL 1a) auf die Apoptoserate und
Zeilproliferation von Mesangiumzellen 54
6.2.1 IL 1a induziert die DNS Fragmentation in Mesangiumzellen 54
6.2.2 IL 1a induziert dosisabhängig die Apoptose von Mesangiumzellen 54
6.2.3 Kinetik der IL 1a induzierten Apoptose von Mesangiumzellen 55
6.2.4 IL 1 a stimuliert nicht die Proliferation von Mesangiumzellen 56
Seite
6.3 Modulation der Apoptoserate von Mesangiumzellen 56
6.3.1 Die Apoptoserate ist abhängig von der Konfluenz der Mesangiumzellen 56
6.3.2 Die Apoptoserate ist abhängig von der Serumkonzentration im Medium 56
6.3.3 Apoptoserate nach kombinierter Stimulation mit TNF a und IL 1a 58
6.3.4 Effekt von Actinomycin auf die TNF a induzierte Apoptose 58
6.4 Untersuchungen zur Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
bei der Apoptose von Mesangiumzellen 58
6.4.1 TNF a und IL 1a induzieren die Synthese von ROS in Mesangiumzellen 58
6.4.2 TNF a und IL 1a induzieren Lipidperoxidation 59
6.4.3 Katalase inhibiert die TNF a / IL 1 a induzierte Produktion von ROS 60
6.4.4 Katalase inhibiert die TNF a / IL 1 a induzierte Lipidperoxidation 61
6.4.5 Katalase inhibiert die TNF a / IL 1 a induzierte Apoptose 61
6.5 Untersuchungen zur Signaltransduktion der TNF a / IL 1a induzierten
Apoptose von Mesangiumzellen 61
6.5.1 Expression des Apoptose Rezeptors TNF a RI 61
6.5.2 Expression des Transkriptionsfaktors C jun 61
6.6 Untersuchungen zur Rolle von Endothelin 2 (ET 2) bei der Apoptose
und Proliferation von humanen ET 2 transgenen Mesangiumzellen 64
6.6.1 Isolation und Charakterisierung von humanen ET 2 transgenen
Mesangiumzellen 64
6.6.2 Die Apoptoserate von humanen ET 2 transgenen Mesangiumzellen 64
6.6.3 Die Proliferationsrate von humanen ET 2 transgenen Mesangiumzellen 65
7.0 Diskussion 66 75
8.0 Danksagung 76
9.0 Lebenslauf 77
10.0 Eidesstattliche Erklärung 78
11.0 Literaturverzeichnis 79 90
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