Entwicklung eines Antisense-Verfahrens gegen den Transkriptionsfaktor TAL1 zur Proliferationsinhibition humaner T-lymphoblastischer Leukämiezellen auf der Basis neuer Befunde zum Transkriptionsmuster des Gens in peripheren Blutzellen gesunder Menschen:
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1997
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4
INHALT
ZUSAMMENFASSUNG
6
1.
EINLEITUNG
8
1.1.
(PROTO-)ONKOGENE
UND
TUMORSUPPRESSORGENE
8
1.2.
TRANSLOKATIONEN
UNTER
BETEILIGUNG
VON
ONKOGENEN
SIND
EIN
BEDEUTENDER
FAKTOR
DER
LEUKAE-
MOGENESE
UND
STEHEN
OFT
IM
ZUSAMMENHANG
MIT
UNPHYSIOLOGISCHER
REKOMBINASEAKTIVITAET.
10
1.3.
DIE
BEDEUTUNG
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
IM
LEUKAEMISCHEN
TUMORGESCHEHEN
14
1.4.
TAL-1,
DER
AM
HAEUFIGSTEN
IN
T-ALLS
DES
KINDESALTERS
GEFUNDENE
GENETISCHE
MARKER,
KANN
DURCH
TRANSLOKATIONEN
ODER
DELETIONEN
IN
ABERRANTER
FORM
VORLIEGEN
UND
KODIERT
VERMUTLICH
EINEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOR.
16
1.5.
OLIGONUKLEOTIDE
ALS
GENTHERAPEUTISCHE
AGENZIEN
23
2.
ZIELSETZUNG
29
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
30
3.1.
ZELLINIEN
0
3.2.
NORMALE
ZELLEN
DES
PENPHEREN
BLUTES
VON
GESUNDEN
SPENDERN
30
3.3.
NUKLEINSAEUREPRAEPARATION
31
3.4.
QUANTIFIZIERUNG
DER
PRAEPARIERTEN
NUKLEINSAEUREMENGEN
32
3.5.
SOUTHEM-BLOTTING
VON
GENOMISCHER
DNA
33
3.6.
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
DER
GENOMISCHEN
DNA
33
3.6.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
DNA-SONDE
33
3.6.2.
HYBRIDISIERUNG
34
3.7.
REVERSE
TRANSKRIPTASE/POLYMERASE-KETTEN-REAKTION-(RT-PCR-)ASSAY
35
3.7.1.
REVERSE
TRANSKRIPTION
DER
TOTALEN
RNA
35
3.7.2.
AMPLIFIKATION
DER
CDNA
DURCH
PCR
35
3.7.3.
SPEZIFISCHE
PCR-PNMER
36
3.8.
QUANTIFIZIERUNG
DER
RT-PCR
PRODUKTE
36
3.9.
BLOTTMG
DER
RT-PCR
PRODUKTE
37
3.10.
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
DER
RT-PCR
BLOTS
37
3.11.
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
(ODN)
DER
ANTISENSE-VERSUCHE
37
3.12.
ANTISENSE-PROLIFERATIONSASSAY
38
3.13.
ASSAY
ZUR
KONTROLLE
DER
ODN-AUFNAHME
IN
DIE
ZELLEN
38
3.14.
STATISTIK
38
4.
ERGEBNISSE
39
4.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
GENOMISCHEN
TAL
1
STATUS
VON
ZEHN
T-ALL
ZELLINIEN
39
4.2.
DIE
EXPRESSION
VON
TAL-1
MRNA
IST
NICHT
VON
EINEM
GENOMISCHEN
REARRANGEMENT
DES
GENS
ABHAENGIG.
39
4.3.
TAL-1
SPEZIFISCHE
MRNA
EXPRESSION
LAESST
SICH
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLTYPEN
DES
NORMALEN
PERIPHEREN
BLUTES
NACHWEISEN.
45
5
4.3.1.
NACHWEIS
EINES
TAL-1
TRANSKRIPTES
IN
NORMALEN
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
DES
PERIPHEREN
BLUTES 45
4.3.2.
NACHWEIS
EINES
TAL
1
TRANSKRIPTES
IN
FRAKTIONEN
GEREINIGTER
T-LYMPHOZYTEN
UND
MONO
ZYTEN 47
4.3.3.
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DER
TAL-1
RT-PCR
DURCH
HYBRIDISIERUNG
MIT
DER
DNA-SONDE
TALEX6
52
4.3.4.
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DER
TAL-1
RT-PCR
DURCH
EIN
ALTERNATIVES
PRIMERPAAR
52
4.4.
DIE
PROLIFERATION
VON
T-ALL
ZELLINIEN
MIT
TAL
DL
LAESST
SICH
MIT
ANTISENSE-OLIGODESOXYNUKLEOTIDEN
GEGEN
DAS
GEN
TAL
1
NEGATIV
BEEINFLUSSEN,
WOBEI
ZWEI
UNTERSCHIEDLICHE
STRATEGIEN
VERFOLGT
WERDEN
KOENNEN.
55
4.4.1.
DIE
PROLIFERATION
VON
CCRF-CEM
ZELLEN
KANN
DURCH
DAS
AS-ODN
CEM(L)
SIGNIFIKANT
UND
SPEZIFISCH
NEGATIV
BEEINFLUSST
WERDEN.
55
4.4.2.
DURCH
DAS
AS-ODN
CEM(2)
LAESST
SICH
KEINE
VERAENDERUNG
DES
WACHSTUMSVERHALTENS
VON
CCRF-CEM
BEOBACHTEN.
57
4.4.3.
DAS
AS-ODN
TAL-1
COMMON
IST
IN
T-ALL
ZELLINIEN
MIT
TAL
DI
SIGNIFIKANT
ANTIPROLIFERATIV
WIRKSAM.
57
4.4.4.
ZELLINIEN
MIT
GENOMISCHER
WILDTYPKONFIGURATION
DER
TAL-1
SEQUENZ
REAGIEREN
IM
PROLIFERA
TIONSASSAY
NICHT
AUF
DAS
AS-ODN
TAL
1
COMMON.
60
4.5.
TITRATION
DER
OPTIMALEN
ANTIPROLIFERATIV
WIRKSAMEN
KONZENTRATION
VON
TAL-1
COMMON.
63
4.6.
DIE
AUFNAHME
VON
CEM(L)
UND
TAL-1
COMMON
IST
EBENSOWENIG
VON
DEM
GENOMISCHEN
TAL-1
STATUS
WIE
VON
DER
ANTIPROLIFERATIVEN
BEEINFLUSSBARKEIT
DER
ZELLINIE
ABHAENGIG.
66
4.7.
MIT
DER
NEGATIVEN
BEEINFLUSSUNG
DER
PROLIFERATION
DURCH
TAL-1
COMMON
GEHT
EINE
VERMIN
DERUNG
DES
STEADY
STATE-NIVEAUS
AN
TAL
1
TRANSKRIPT
EINHER.
66
5.
DISKUSSION
71
5.1.
VERBESSERTE
SENSITIVITAET
DER
NACHWEISMETHODE
LEGT
DIE
VERMUTUNG
NAHE,
DASS
TAL-1
REGELHAFT
IN
T-ALL
ZELLINIEN
EXPRIMIERT
WIRD.
71
5.2.
TAL-1
EXPRESSION
PER
SE
KANN
NICHT
ALS
KRITISCHER
LEUKAEMOGENER
FAKTOR
BEI
DER
ENSTEHUNG
VON
T-ALLS
ANGESEHEN
WERDEN.
72
5.3.
CEM(1)
VERMITTELT
EINE
LANGANHALTENDE
ANTIPROLIFERATIVE
WIRKUNG
AUF
CCRF-CEM,
AN
DEREN
ZUSTANDEKOMMEN
OFFENSICHTLICH
RNASE-H
AKTIVITAET
BETEILIGT
IST.
78
5.4.
DIE
ZELLINIENSPEZIFISCHE
STRATEGIE
MUSS
NICHT
DIEJENIGE
MIT
DER
HOECHSTEN
EFFEKTIVITAET
SEIN.
82
5.5.
TAL-1
COMMON
IST
VERMUTLICH
AUFGRUND
ALTERNATIVER
PROMOTORUTILISATION
IN
T-ALL
ZELLEN
MIT
WILDTYPKONFIGURATION
DES
GENS
UNWIRKSAM.
83
5.6.
WEITERFUEHRENDE
GEDANKEN
IM
HINBLICK
AUF
EINEN
IN
VIVO-ASSAY
84
6.
LITERATUR
87
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 99
DANKSAGUNG
100
LEBENSLAUF
101 |
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